微量凱氏定氮法

1、微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法目的目的1.掌握應(yīng)用微量凱氏定氮法測定樣品總氮量蛋白質(zhì)的原理和方法2.學(xué)會使用凱氏定氮儀原理原理凱氏(Kjeldahl)定氮法常用于測定天然有機物(如蛋白質(zhì)，核酸及氮基酸等)的含氮量。含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫被分別氧化成CO2和H2O，氮則轉(zhuǎn)變?yōu)榘保⑦M(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨，是為“消化”。該反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。以

2、甘氨酸為例，其消化過程可表示如下：NH2濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，可借助水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量及一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結(jié)合，生成銨離子，使溶液中的氫離子濃度降低；然后用標(biāo)準(zhǔn)無機酸滴定，直至恢復(fù)溶液中原來的氫離子濃度為止，最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)(相當(dāng)于待測物中氨的當(dāng)量數(shù))即可計算出待測樣品中的氮含量。OHNHSONaNaOHSONH4424222)4(??????324NHOHOHN

3、H324333BOHNHBOHNH??334324BOHCLNHHCLBOHNH???滴定時用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.2~5.6，將NH4H2BO3的藍(lán)綠色滴至原來H3BO3的藍(lán)紫色即為終點。本法適用范圍0.2~1.0mg氮，相對誤差應(yīng)小于2%。材料、試劑與器具材料、試劑與器具材料材料魚肉、血清等含蛋白質(zhì)樣品試劑試劑1.濃硫酸(化學(xué)純)2.30%氫氧化鈉(分析純)溶液3.硫酸鉀硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅以3:1(

4、WW)配比混合研磨成粉末4.混合指示劑：0.1%甲烯藍(lán)乙醇溶液50ml與0.1%甲基紅乙醇溶液200ml混合配成(貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時為紫色，堿性時為綠色，變色范圍窄且靈敏)????????32224224323NHOHSOCOSOHCOOHCH424423)(2SONHSOHNH??開放P3，使水進(jìn)入A室，漏斗D中加蒸餾水約10ml入B室。用拇指將管口按緊，同時開放P1，則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經(jīng)K管流出

5、，一般情況下如此重復(fù)洗滌兩次即可。若蒸餾器內(nèi)有氨存在，則應(yīng)加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用(可用pH試紙檢查)。A為蒸氣發(fā)生室，P3為其開關(guān)，P1為出水開關(guān)，B為蒸餾室，與出氣管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的錐形瓶，B室內(nèi)有Y型管，一端與A室相通，另一端經(jīng)P4與漏斗D相連，可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室，F(xiàn)為冷凝管，E為進(jìn)水管，水經(jīng)F、G、K而流出，蒸餾時依次在B室加入消化好的樣品及NaOH二者反應(yīng)產(chǎn)生氨，經(jīng)M管進(jìn)入錐形瓶由硼酸吸收

6、。2、空白蒸餾：蒸餾器洗凈后，開放水龍頭P3，使水進(jìn)入A室，水放至A室球部23即可。取1個50ml錐形瓶，準(zhǔn)確加入10ml硼酸指示劑混合液，用表面皿復(fù)蓋備用。加樣：用移液管吸取1ml蒸餾水，細(xì)心地由漏斗D傾入蒸餾室。將盛有硼酸指示劑的錐形瓶置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液。用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉8ml，隨即將P4夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉(水封)。蒸餾：用酒精燈加熱(注意防風(fēng)以維持火力恒定)，待硼酸指示劑變綠時開始計時

7、；3~5min后將錐形瓶放低，使導(dǎo)管離開液面再蒸餾2min，最后用蒸餾水沖洗導(dǎo)管外壁。蒸餾完畢后取下錐形瓶，撤火，隨即將蒸餾器洗凈。3、樣品蒸餾：用移液管分別吸取兩份1ml樣品消化液，按上述操作步驟進(jìn)行蒸餾(注意在加樣后應(yīng)用適量蒸餾水清洗漏斗)。㈢滴定：滴定：用0.0500N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定蒸餾吸收液至淡紫色或灰色，記錄所用鹽酸的量。㈣計算計算1001000140100.0)(%)克克(克克克克克克克??????CB（A若測定的樣品含氮

8、量部分只是蛋白性，(如血清)則：樣品的總蛋白含量(克蛋白%)=100100025.6140100.0)(??????CBA式中：A為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)；B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)；C為稱量樣品的克數(shù)；0.0100為鹽酸的當(dāng)量濃度(應(yīng)為本實驗使用鹽酸的實際濃度)；14為氮的原子量；6.25為常數(shù)。若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質(zhì)，則樣品蛋白質(zhì)含量的測定要更復(fù)雜一些。首先需向樣品中加入適量的三氯乙酸(使蛋白質(zhì)變性沉淀)，