激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

1、激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用激光生物學(xué)報(bào)1998年6月第7卷第2期陳耀文1林玨龍1賴效瑩2梅品超1（1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室2物理單字與信息學(xué)教研室廣東汕頭515031）摘要激光掃描共聚焦顯微鏡是近十年發(fā)展起來(lái)的醫(yī)學(xué)圖象分析儀器，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于熒光定量測(cè)量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)監(jiān)測(cè)和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學(xué)顯微鏡質(zhì)的飛躍，是電子顯微鏡的一個(gè)補(bǔ)充。本文以美國(guó)Meridian公司的A

2、CASULTIMA312為例簡(jiǎn)要介紹了激光掃描共聚顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，功能和生物學(xué)應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞激光；共聚焦顯微鏡；粘附細(xì)胞分析與篩選（ACAS）TheLaserScanningConfocalMicroscopyMicroscopySystemitsBiologicalApplicationsAhstractAhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimagea

3、nalysisinstrumentwhichisdevelopedinthelastdecade.Nowitiswidelyappliedinsuchfieldsasfluescentquantitativemeasurementconpocalimagelyusis3DreconstructionKiicsignalmonitiingoflivingcellcellcellcommunicationresearchesetc.Inth

4、ispaperACSAULTIMA312(MeridianCoUSA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopyitsfuionsbiologicalapplications.KeyKeywdswdsLaserConfocalMicroscopyAdherentCellAnalysissting(ACSA)激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserscanningCo

5、nfocalMicroscopy，簡(jiǎn)稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域[1、2、3]，對(duì)生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位

6、研究具有很大的優(yōu)越性，為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。創(chuàng)建于1983年的美國(guó)Meridian公司，在90年代推出的“激光掃描共聚焦顯微鏡”這一項(xiàng)具有劃時(shí)代的義意的高科技產(chǎn)品，曾獲得美國(guó)“政府新產(chǎn)品獎(jiǎng)”和兩次“高科技領(lǐng)先技術(shù)獎(jiǎng)”，它能達(dá)到每秒120幅畫(huà)面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產(chǎn)品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器

7、?，F(xiàn)以該儀器為例介紹激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)及其在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用。1、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成有關(guān)共聚焦顯微鏡的某些技術(shù)原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年WijnaendtsVanRest發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，到了1987年，才發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。ACASULTI

8、Ma312系統(tǒng)采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的軟件將激光細(xì)胞儀與先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合，產(chǎn)生快速、高效、靈活的操作系統(tǒng)，完備的數(shù)據(jù)采集、分析與管理功能?；谏镝t(yī)學(xué)研究有如下的軟件。ImageAnalyze—對(duì)于單色、比色和三色標(biāo)記的二維熒光圖像的定量分析，可產(chǎn)生透射光圖像重疊，同時(shí)AutoImage可多個(gè)區(qū)域的自動(dòng)掃描和熒光定量，以及相同區(qū)域的時(shí)間順序掃描。RatioAnalysis和Kiics—測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的離子變化，可有點(diǎn)掃描、線掃描及圖像掃描三種測(cè)定

9、形式，以監(jiān)測(cè)各種速率的生物反應(yīng)。Cell–CellCommunicationFRAP相鄰細(xì)胞的FRAP分析。該軟件首先用可光淬滅特異的細(xì)胞熒光，然后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)掃描，此掃描可對(duì)單一區(qū)域或細(xì)胞的多個(gè)選擇區(qū)域，可產(chǎn)生透射光圖像并與其它圖像重疊。CellList—儲(chǔ)存被選擇細(xì)胞的位置，即可自動(dòng)對(duì)較大樣品進(jìn)行掃描，又可產(chǎn)生較小樣品特異部位的網(wǎng)絡(luò)位置表，以進(jìn)行自動(dòng)的測(cè)量、篩選和重復(fù)測(cè)定。CellSting—ACAS具備如下四種分選方式：Ablat

10、ionSt:預(yù)選定義一個(gè)熒光閾值，然后對(duì)特定細(xì)胞殺傷。②CookieCutterSt在用戶定義的中心點(diǎn)四周切割Cookies。③QuickSt：對(duì)已定義的細(xì)胞表列，用Ablation或CookieCutter作分選。④ManualSt：直接使用鼠標(biāo)控制載物臺(tái)位置及激光脈沖，并殺滅和分選細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作。ConfocalImaging—共聚焦分析，可實(shí)現(xiàn)Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬熒光處理法，

11、DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點(diǎn)移動(dòng)動(dòng)畫(huà)。3激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用3.1定量熒光測(cè)量ACAS可進(jìn)行重復(fù)性極佳的低光探測(cè)及活細(xì)胞熒光定量分析。利用這一功能既可對(duì)單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測(cè)定，還可測(cè)定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測(cè)定，這種定量可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如

12、腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息。3.2定量共聚焦圖像分析借助于ACAS激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像。可得到完整活的或固定的細(xì)胞及組織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。能測(cè)定細(xì)胞光學(xué)切片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴(kuò)散、胞內(nèi)離子等，亦可以對(duì)這些動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)及定位分析。3.3三維重組分析生物結(jié)構(gòu)ACAS

13、使用SFP進(jìn)行三維圖像重組，SFP將各光學(xué)切片的數(shù)據(jù)組合成一個(gè)真實(shí)的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來(lái)突出其特征，產(chǎn)生更生動(dòng)逼真的三維效果。3.4動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定Ca2、pH及其它細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)定，利用ACAS能迅速對(duì)樣品的點(diǎn)，線或二維圖像掃描，測(cè)量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如Indo1、BCECF、Fluo3等多種熒光探針對(duì)各種離子作定量分析。可以直接得到大分子的擴(kuò)散速率，能定量測(cè)定細(xì)胞溶液中Ca2對(duì)腫