免疫細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測結(jié)核抗原在結(jié)腦診斷中的價值.pdf

1、目的:結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM),是由結(jié)核分枝桿菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,是結(jié)核病中最嚴(yán)重的類型之一,致殘率和致死率較高。近年來由于多重耐藥結(jié)核菌的流行、人類免疫缺陷病毒的感染及貧窮等多種因素的影響,結(jié)腦的發(fā)病率呈日益回升的趨勢。早期診斷、早期治療是影響預(yù)后的關(guān)鍵。但結(jié)腦的診斷,尤其是早期診斷比較困難,腦脊液(CSF)中檢測到結(jié)核分枝桿菌可作為結(jié)腦診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但涂片抗酸染色和結(jié)核菌培

2、養(yǎng)陽性率很低,對臨床早期診斷價值有限。目前尚無一種可靠實(shí)用的診斷方法能夠滿足臨床診斷的需要。結(jié)核分枝桿菌侵入機(jī)體后被單核巨噬細(xì)胞吞噬,體內(nèi)首先出現(xiàn)的是結(jié)核分枝桿菌特異性抗原,故結(jié)核抗原的檢測可以作為結(jié)核桿菌存在的直接證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過對腦脊液單核細(xì)胞內(nèi)的ESAT-6和PPD兩種結(jié)核抗原的檢測,比較兩者對結(jié)核性腦膜腦炎的診斷價值,為結(jié)核性腦膜腦炎的診斷尋求一種更有效的方法。
　　 方法:病例組為35例臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎患者,對照

3、組為35例非結(jié)核性腦膜炎患者。所有患者均進(jìn)行腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)檢查及阿利新蘭染色,并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和免疫熒光雙標(biāo)記染色法檢測腦脊液單核細(xì)胞內(nèi)的ESAT-6及PPD抗原,以Shandon Cytospin4離心沉淀儀收集腦脊液細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色采用SP法,置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察,單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)有棕黃色或黃褐色顆粒沉積的為陽性,單核細(xì)胞的胞漿無色為陰性結(jié)果。免疫熒光雙標(biāo)記染色法以Cy5和FITC熒光二抗及4,6-二脒基

4、-2-苯基吲哚(DAPI)分別標(biāo)記抗ESAT-6單抗、抗PPD多抗及所有細(xì)胞核DNA,置于激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察,ESAT-6陽性的單核細(xì)胞呈胞核藍(lán)色、胞漿紅色;PPD陽性的單核細(xì)胞呈現(xiàn)出胞核藍(lán)色、胞漿綠色的完整結(jié)構(gòu);陰性細(xì)胞只出現(xiàn)藍(lán)色的胞核結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:
　　 1、臨床資料
　　 結(jié)腦患者可表現(xiàn)為發(fā)熱、頭疼、腦膜刺激征陽性、腦局灶體征、意識障礙等,但卻乏特異性,不易于其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病相鑒別

5、,合并顱外結(jié)核支持結(jié)腦的診斷。
　　 2、腦脊液常規(guī)、生化檢查結(jié)果
　　 結(jié)腦組,總細(xì)胞數(shù)平均502.60±457.67×106/L;白細(xì)胞數(shù)平均為310.37±292.20×106/L;葡萄糖平均為1.87±0.87mmol/L;蛋白平均為1.62±0.65g/L;氯化物平均為109.68±9.25mmol/L;腰穿壓力平均為277.19±93.56mmH2O。對照組,總細(xì)胞數(shù)平均473.63±1545.95×106/

6、L;白細(xì)胞數(shù)平均為132.37±293.46×106/L;葡萄糖平均為2.91±0.95mmol/L;蛋白含量平均為0.76±0.79g/L;氯化物平均為119.25±6.76mmol/L;腰穿壓力平均為225.56±122.38mmH2O。
　　 結(jié)腦組腦脊液中的白細(xì)胞數(shù)、蛋白含量較對照組明顯升高,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;結(jié)腦組葡萄糖、氯化物含量與對照組比較,明顯降低,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;腦脊液總細(xì)胞數(shù)和腰

7、穿壓力兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、腦脊液細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)
　　 結(jié)腦組,35例患者中有25例為混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng),8例以嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主,2例是以淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主。對照組,35例患者中有5例為混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng),5例以嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)為主,18例以淋巴細(xì)胞反應(yīng)為主,4例呈激活單核樣細(xì)胞學(xué)反應(yīng),3例腦脊液細(xì)胞學(xué)正常。結(jié)腦組混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng)約占71.43％,明顯高于對照組14.29％,混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng)對診斷結(jié)腦有重要的意義,動態(tài)

8、觀察腦脊液細(xì)胞學(xué)的變化,對結(jié)腦的治療及判斷預(yù)后有一定的應(yīng)用價值。
　　 4、腦脊液單核細(xì)胞內(nèi)ESAT-6抗原的檢測
　　 35例結(jié)核性腦膜炎患者中,經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色有29例陽性,對照組中有2例陽性,ESAT-6抗原的敏感性為82.86％,特異性為94.29％,病例組與對照組比較,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)記染色病例組中28例陽性,對照組中有l(wèi)例陽性,ESAT-6的敏感性為80％,特異性為97.14％

9、,病例組與對照組經(jīng)統(tǒng)計分析P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;兩種方法聯(lián)合檢測ESAT-6抗原,病例組中有30例陽性,對照組中有2例陽性,敏感性為85.71％,特異性為94.26％。
　　 5、腦脊液單核細(xì)胞內(nèi)PPD抗原的檢測
　　 病例組中,免疫細(xì)胞化學(xué)染色有30例陽性,對照組中有6例陽性,PPD的敏感性為85.71％,特異性為82.86％,病例組與對照組比較,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;在免疫熒光雙標(biāo)記染色中有29例

10、陽性,對照組中有5例陽性,PPD的敏感性為82.86％,特異性為85.71％,兩組相比較,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;兩種方法聯(lián)合檢測PPD抗原,病例組中有31例陽性,對照組中有8例陽性,敏感性為88.57％,特異性為77.14％。
　　 6、ESAT-6及PPD抗原診斷TBM優(yōu)劣比較
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合免疫熒光雙標(biāo)記染色,檢測ESAT-6和PPD抗原,將兩者的敏感性和特異性分別進(jìn)行X2檢驗(yàn),敏感性P＞0.0

11、5,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,特異性P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。故兩種方法聯(lián)合檢測ESAT-6抗原的特異性大于PPD抗原。
　　 結(jié)論:結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液單核細(xì)胞內(nèi)存在結(jié)核抗原,結(jié)核抗原的檢測可為結(jié)腦的早期診斷提供有力的依據(jù)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法聯(lián)合免疫熒光雙標(biāo)記染色法可提高檢出率,其檢測ESAT-6抗原的敏感性為85.71％,特異性為94.26％;檢測PPD抗原的敏感性為88.57％,特異性為77.14％,經(jīng)統(tǒng)計分析兩種方法聯(lián)合