口腔生物學實驗教程

1、第七章 口腔生物學實驗教程,提要：口腔生物學實驗教程是針對口腔生物學理論課設計的實驗指導內容。其教學目的是讓學生通過實驗，掌握基本的口腔生物學研究技術和方法，加深對理論課所學知識的理解，培養(yǎng)學生對口腔醫(yī)學基礎研究的興趣，了解基本的科研設計思路，啟發(fā)學生的科研思維。,內容目錄,第一節(jié) 口腔微生物學實驗 實驗一 菌斑的采集、染色和觀察、分類 實驗二 變異鏈球菌的分

2、離和鑒定 實驗三 細菌代謝酸的測定 實驗四 細菌細胞外葡聚糖的測定 實驗五 菌斑中pH值的測定 第二節(jié) 口腔生物化學實驗 實驗六 齦溝液中堿性磷酸酶活性的測定 實驗七 唾液鈣和磷含量的測定 實驗八 唾液分泌情況的測定,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學 實驗九 以釉原蛋白基因進行性別鑒定第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng) 實驗十

3、 成骨細胞的分離培養(yǎng) 實驗十一 成骨細胞的分離培養(yǎng) 實驗十二 MTT法檢測細胞活性 實驗十三 腫瘤細胞遷移實驗（細胞劃痕法）,內容目錄,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗一 菌斑的采集、染色和觀察、分類,實驗目的與要求: 掌握牙菌斑標本的采集、處理和常用染色——剛果紅（congo red）負性染色的主要程序和方法，熟悉齦上或齦下菌斑中常見細菌的形態(tài)及分類方法。實驗內容:

4、 菌斑標本的采集；細菌涂片的制備、染色；染色細菌的觀察及 Listgarten分類。實驗設備和器材等用品： 香柏油，二甲苯，菌斑染色劑，酒精，濃鹽酸和滅菌的液狀石蠟等。無菌牙科鑷子、挖匙或探針（齦上菌斑檢查用），載玻片，滅菌取菌環(huán)可卸式取菌器或消毒濾紙（齦下菌斑采集用），含預還原轉送培養(yǎng)基的帶蓋小瓶，普通光學顯微鏡，試鏡紙，細菌接種環(huán)及裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿等。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗方法：,菌斑采集和處理,染

5、色,觀察,分類,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,①齦溝內采集法 ②牙周袋內采集法,齦溝或牙周袋的齦下菌斑采集法,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,剛果紅負性染色方法：,Listgarten的分類標準：,球菌：菌細胞直徑0.5μm～1.0μm，包括少量球桿菌；直桿菌：菌細胞寬0.5μm～1.5μm，長1.0μm～1.9μm，包括部分分支桿菌；絲狀菌：菌細胞寬0.5μm～1.5μm，長與寬之比大于6∶1，菌細胞多為不

6、規(guī)則的長絲狀桿菌；梭狀菌：菌細胞直徑0.3μm～1.0μm，長約10μm，其末端呈梭狀；彎曲桿菌：菌細胞呈新月形或彎曲狀；螺旋體：菌細胞寬0.2μm～0.5μm，長約10μm～20μm，螺旋形，包括大、中、小三種螺旋體。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗結果與分析：,注意事項： 1.染色操作中，用濃鹽酸熏蒸涂片時要小心。 2.該法不能檢測細菌的活動性，但染色涂片可長期保存。思考題：

7、 剛果紅負性染色有何優(yōu)點？菌斑采集時應該注意什么？,齦上菌斑涂片剛果紅負性染色結果,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗二 變異鏈球菌的分離和鑒定,實驗目的和要求： 通過對菌落特點和菌細胞形態(tài)及革蘭染色特征的觀察，初步掌握菌斑標本中變異鏈球菌的分離、培養(yǎng)和表型鑒定的主要程序和方法，熟悉牙菌斑中常見細菌的菌落特點、菌細胞形態(tài)及革蘭染色特點。 實驗原理： 變異鏈球菌能發(fā)酵蔗糖等多種碳水化合物，而其他口腔鏈球菌不發(fā)酵

8、山梨醇和甘露醇；根據(jù)其菌落形態(tài)、染色特點及耐氧情況，以其特殊的生化反應可以分離和鑒定變異鏈球菌。實驗內容：,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,主要實驗設備和器材、試劑等：厭氧培養(yǎng)裝置如簡易厭氧袋、厭氧罐、厭氧培養(yǎng)箱或厭氧手套箱均可；普通孵箱，旋渦混合器，微量振蕩器，和普通光學顯微鏡。可調式移液器、加樣頭，小試管，三角形推棒，接種環(huán)、酒精燈，載玻片，無菌棉簽，96孔反應板，EP管；口腔檢查用口鏡，鑷子，檢查盤，無菌紗球，無菌探針和齦上鋤形

9、潔治器。革蘭染色試劑，系列生化基質和指示劑（包括甘露醇、山梨醇、菊糖、精氨酸試劑、七葉苷水解試劑）。變異鏈球菌ATCC25175懸液。MS瓊脂、BHI瓊脂培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鹽轉送液，0.2mol/L、pH 7.0～ 的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗方法：變異鏈球菌群細菌的分離和表型鑒定,菌斑標本,接種到MS或TS瓊脂上,微氧孵育（37℃、5%～10% CO2 48小時）或厭氧孵育（37℃48

10、小時、90%N2+ 10%CO2或 80%N2+10%CO2+10%H2）,菌落、菌細胞形態(tài)檢查,生化鑒定,確定菌種,,,,,,,次代培養(yǎng)純化、富集,分散、稀釋,置轉送液中運送,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,革蘭染色步驟：,細菌涂片加熱固定,加革蘭（堿性結晶紫）甲液、乙液各一滴，混勻后初染30秒,革蘭碘液媒染30秒,丙酮-乙醇混合脫色劑脫色5～10秒,石炭酸復紅復染5秒,干燥后1000倍顯微鏡油鏡下觀察,水洗,,,,,,水洗,水洗,水洗,

11、第一節(jié) 口腔微生物學實驗,表型鑒定——（1）菌落特征觀察,初代培養(yǎng)的菌落觀察要點： 形態(tài)：如水滴狀、圓形、絲狀、不規(guī)則狀、根狀、梭形等。 大?。壕渲睆揭话阋詍m計，注意大小的一致性。 厚?。罕馄健⑶馉?、凸、半球狀、瘤狀(中央凸)。 顏色：無色、白、黃、紅、綠、黑或棕色。 邊緣：如整齊、鋸齒狀、波狀等。 透明度：透明、半透明、不透明。 菌落型：光滑、粗糙、黏液樣。 溶血型

12、：α、β、γ（限血平板）。,實驗結果及結果評價,在5%～10%CO2、90%～95%的N2，或80% N2、10%CO2和10%H2的大氣環(huán)境下37℃孵育48小時,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,表型鑒定——（2）菌細胞形態(tài)和染色特征觀察,菌細胞形態(tài)：球形、桿形、球桿形、彎曲狀、梭狀、菌細胞末端形狀、細胞內有無顆粒、腫脹等。革蘭染色特征：陽性、陰性染色,染色均勻性。,實驗結果及結果評價,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,生化鑒定：,革蘭染色鑒定

13、次代培養(yǎng)為純培養(yǎng)后，收集瓊脂表面的菌苔，用PBS稀釋成2×109/ml菌量,取待測的細菌懸液100μl，加入10個反應板微孔中,分別加入100 μl不同的生化基質，各加2孔,同時加PBS為陰性對照，加變異鏈球菌ATCC25175為陽性對照,振搖混合30秒后，37 ℃孵育4小時-24小時,取出反應板，加入指示劑，觀察記錄結果,,,,,,實驗結果及結果評價,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,生化鑒定——反應板微量快速生化實驗名稱、試劑及

14、結果：,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,反應板微量快速生化實驗：利用細菌產生的預成酶（胞外酶），在37℃普通孵箱中與生化試劑基質產生特異的酶反應，通過各種指示劑或特殊的顯色產物即可在4小時～24小時觀察到結果。反應板微量快速生化實驗的生化鑒定系統(tǒng)包括30個生化實驗基質與相關指示劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）、細菌標準濁度管以及8個鑒定系列,可根據(jù)細菌的形態(tài)、染色性及耐氧實驗結果選擇不同的系列生化基質進行鑒定。這8個鑒定系列是： ①

15、革蘭陽性厭氧球菌 ②革蘭陰性厭氧球菌 ③革蘭陽性無芽胞厭氧桿菌 ④革蘭陰性無芽胞厭氧桿菌：a.不產黑色素的革蘭陰性厭氧短桿菌； b.產黑色素的革蘭陰性厭氧短桿菌；c.革蘭陰性厭氧梭狀或長桿菌 ⑤革蘭陰性彎曲菌 ⑥梭菌屬 ⑦變異鏈球菌和其他口腔鏈球菌 ⑧微需氧的革蘭陰性厭氧桿菌,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,菌種鑒定——變異鏈球菌群細菌的

16、鑒別：,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗注意事項：,要設陽性和陰性對照。細菌濃度對實驗結果的影響 濃度低可導致假陰性結果，最佳的細菌濃度為 2.1×1010/ml～2.4×1010/ml,如菌濃度略低可適當延長酶反應時間。酶反應時間與菌種的關系 酶反應時間因不同菌種有所差異，以4小時～24 小時為宜。待測標本放置時間 以新鮮的放置24小時～48小時培養(yǎng)物為宜。如標本不能 立即做生化實驗，可將其

17、放置在4℃冰箱內，時間最好不超過96小時。預成酶微量生化實驗所用細菌應來自不加血的非選擇培養(yǎng)基，以避免產生 假陽性結果。,實驗報告： 變異鏈球菌的分離與鑒定。思考題： 變異鏈球菌的菌細胞形態(tài)特征、菌落特征、耐氧特征和生化反應特征主要有哪些？,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗三 細菌代謝酸的測定,實驗目的與要求： 學習用色譜技術定性和定量檢測分析細菌代謝脂肪酸的基本方法。實驗原理：

18、 各種脂肪酸在色譜柱（固定相）及流動相中的分配系數(shù)、吸附能力不同，導致它們在柱中的保留時間有所差異。同種酸停留時間相同；峰面積與含量正相關。 實驗內容： 1.液體純培養(yǎng)增菌。 2.色譜層析技術測定細菌培養(yǎng)液中短鏈脂肪酸的種類及相對含量。實驗主要設備、器材等： 色譜儀，細菌培養(yǎng)箱，離心機，PH計，三角燒瓶，接種環(huán)，移液 器，微量注射器和EP管等。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗方法：,

19、樣品制備：,色譜層析：,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗結果分析： 結果計算： 培養(yǎng)液中各組分保留時間與標準酸圖譜比較定性，按下式計算： C有機酸 =,注意事項：實驗前要用流動相平衡分析柱；注意溫度對分析結果有影響。

20、,實驗報告與評定：細菌代謝酸測定。思考題： 色譜層析實驗中哪些方面非常重要？ 細菌代謝酸的測定除了采用色譜層析技術以外，還可以用哪些方法測定？,Area有機酸,Area標準×C標準,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗四 細菌細胞外葡聚糖的測定,實驗目的與要求： 變異鏈球菌可以產生葡糖基轉移酶，綜合蔗糖產生細胞外多糖即水溶性或不溶水葡聚糖。通過實驗要掌握用比色法測定葡聚糖含量的方法和原理。實驗原理：

21、 糖在強酸溶液中加熱，脫水生成羥醛，再變成呋喃衍生物。此衍生 物可以與各種試劑反應生成有色物質，然后用分光光度計測得密度值，進而計算出糖的含量。以蒽酮法為例,其可與單糖、雙糖、糊精和淀粉反應生成有色 化合物，在一定的濃度范圍內，測得的葡聚糖含量與光密度值成正比。實驗內容： 蒽酮法測定變異鏈球菌培養(yǎng)液中細胞外葡聚糖的含量。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗主要設備和器材：蒽酮試劑 稱取200mg蒽酮溶解于10

22、0ml濃硫酸中攪拌溶解。4℃冰箱可保存2～3周。葡聚糖標準儲存液 稱取1.0g葡聚糖，溶于100ml水中制成儲存液。使用時吸取1.0ml稀釋至100ml，儲存于4℃冰箱中。分光光度計，離心機，10ml試管，恒溫水浴箱，水浴鍋及吸管，移液器，氫氧化鈉等。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗方法：,樣品處理：將水溶性和非水溶性多糖分開測定，即：,測定：將水溶性和非水溶性多糖分開測定，即：,1. 標準曲線 按下表配制標準液。攪拌3分鐘

23、后放入95℃水浴中加熱6分鐘，冷卻，用分光光度計測量波長625nm的光密度值，繪制標準曲線。,2. 樣品測定 取樣品1.0ml(質量濃度在20μg/L～40μg/L為宜)，加蒽酮試劑3ml，95℃水浴煮沸6分鐘，冷卻后測其625nm處的OD值，根據(jù)標準曲線及稀釋倍數(shù)計算樣品中葡聚糖的含量。,注意事項： 配置標準液時應在15℃水浴中加入蒽酮。實驗報告評定： 細菌細胞外葡聚糖的測定。 思考題： 細菌細胞

24、外多糖有幾種？如何分別檢測這些細菌細胞外多糖？,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,實驗五 菌斑中pH值的測定,實驗目的與要求： 菌斑pH的測定可分為兩大類，即活體測定與離體測定。 電極接觸法(touch pH electrode method) 活體測定 埋藏電極遙測法(intraoral or indwelling pH electrode systems) 離體測定

25、：如人工菌斑法,實驗內容： 1. 電極接觸法 是活體菌斑pH檢測法，即將手持的微電極置于原位的菌斑表面來測定菌斑的pH。 2. 埋藏電極遙測法 是體內檢測方法。 3. 人工菌斑法 人工菌斑法是先建立人工菌斑模型，然后用未刺激和刺激的唾液同菌斑作用，同時電極測定pH變化。實驗主要設備和器材： 微電極，吸液用注射器，pH計，隔濕用消毒棉球等。,,,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,1.

26、 電極接觸法 是活體菌斑pH檢測法，即手持微電極測定菌斑pH的方法。（1）用注射器吸取1ml標準pH溶液，滴入電極敏感端部位，校正pH計。（2）受試者2天不漱口刷牙，測試前2小時不進食。（3）用棉卷隔濕并用氣槍吹干測試部位。（4）測定“靜態(tài)”pH：手持微電極置于原位的菌斑表面，待離子計數(shù)穩(wěn)定時記錄pH值。每一時間點測試受試者同一顆牙的上下左右4個位點，取其平均值即為菌斑原位pH值，且4個位點在1分鐘內完成測試。（5）測定

27、動態(tài)pH：受試者可先測定靜態(tài)PH值；再讓受試者進食不同的食物，在一定的時間間隔中測定動態(tài)pH；也可分別測定齲齒敏感部及鄰牙界面的PH。（6）測試操作： ① 測定時，將微型玻璃電極或銻電極直接插入要測的牙菌斑中； ② 參比電極通過飽和氯化鉀鹽橋與受檢者身體相連，多放在前臂或口底； ③ pH計也可連接自動描繪裝置，將測到的pH直接繪制成圖。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,2.埋藏電極遙測法 是菌斑pH的體

28、內檢測方法。（1）用注射器吸取1ml標準pH溶液滴入電極敏感端部，校正pH計。（2）將一個微型玻璃電極埋入離體的釉質小塊中。（3）用棉卷隔濕并用氣槍吹干測試區(qū)域。（4）將埋入釉質小塊中的微型玻璃電極放入局部義齒中，戴入受檢者口腔內缺牙的部位，讓電極的敏感面向著基牙的鄰面和咬合面。也可在電極的后方接一個微型的場效應晶體管，以增加傳導速度，提高敏感性，減少干擾。（5）參比電極的接法一般與接觸法相同，或者也埋入義齒中，以細導線與口外

29、連接。（6）根據(jù)實驗要求觀察菌斑在電極頭的聚集和pH變化情況。（7）電極敏感端的菌斑可以確定為類似于鄰面或窩溝部位的牙菌斑。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,3. 人工菌斑法 是先建立人工菌斑模型，然后用未刺激和刺激的 唾液同菌斑作用，同時用電極測定pH變化。在整個測試過程中，人工唾液均處于流動狀態(tài)，且流速可變。,實驗報告評定： 菌斑中pH值的測定。思考題： 三種測試pH的方法各有何優(yōu)缺點？,注意事項： 菌

30、斑中pH值受多方面因素的影響，如口腔環(huán)境、唾液、飲食的 酸堿度以及口腔清潔情況等，因此測定時要做好隔濕防護。,第一節(jié) 口腔微生物學實驗,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗目的與要求： 牙周炎處齦溝液中該酶的活性變化與牙周袋探診深度和炎癥程度明顯正相關，與牙周炎破壞和牙周組織狀況相關。通過實習要求掌握齦溝液中ALP的基本檢測方法。 實驗原理：——ELISA法定量測定ALP,實驗內容： 1.齦溝液樣品采集與制備

31、； 2.ELISA法測定ALP的染色操作； 3.酶標儀測定吸光度值，確定ALP的相對含量。,實驗六 齦溝液中堿性磷酸酶活性的測定,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,齦溝液采集,洗提,ELISA法檢測ALP,酶標儀測定OD450nm值,,,,實驗方法：,主要實驗設備和器材：,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,注意事項：齦溝液的量少，易受多種因素影響，采集時動作要輕柔，排除全身影響因素（如生理周期、性激素等）和局部刺激因素，并注

32、意防止污染。每次實驗留一孔作為空白調零孔(不同于空白孔)，測量時先用此孔調OD值至零。嚴格按規(guī)定的時間和溫度進行孵育。所有試劑必須在用前恢復至室溫；用后應立即冷藏。洗板很重要，在加入檢測溶液B或底物前要盡量吸干孔內液體，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。實驗時酶標板加蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,注意事項：操作時要帶手套，板底勿殘留的液體和手指印，否則

33、影響OD值的準確性。在儲存和孵育時要避免強光直接照射，底物避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。未用完的酶標板或試劑務必于2℃～8℃保存，避免不準確稀釋而造成的濃度誤差；檢測液及底物溶液要在用前配制，且應37℃溫育30分鐘。加樣或加試劑時，應注意減少時間間隔，以保證準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)最好控制在10分鐘以內，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準

34、確性。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗結果及分析： 根據(jù)齦溝液中ALP含量檢測的OD值結果、空白對照等，分析實驗結果。思考題： 哪些因素能影響齦溝液中堿性磷酸酶的含量測定？,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗七（1）唾液鈣含量的測定,目的和要求：了解分光光度法的定量原理，熟悉減少實驗誤差、提高準確度的方法和操作技術，掌握利用市售試劑盒測定唾液中鈣濃度的原理和方法。,實驗原理：,實驗主要用品和設備：,第二節(jié)

35、 口腔生物化學實驗,實驗方法：1. 唾液收集及處理 收集非刺激性唾液約0.5ml，3000r/min離心10min，取上清液備測。2. 分光光度計測定 準備三組EP管，按下表順序分別加入試劑： 3.各管在振蕩器上混勻，以空白管校正零點，在分光光度計上測定612nm波長下的OD值，按下式計算含量： 樣品中鈣的濃度（mmol/L)=樣品管光密度/標準管光密度×2

36、.5,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,思考題： 試分析誤差產生的原因？含量計算的方法有哪些？,注意事項：為保證測試結果的可靠性，所有實驗器皿一定要清洗干凈且用三蒸水多次沖洗、烤干后待用。也可在試劑中加入少量的 EDTA 作掩蔽劑，消除實驗器皿和試劑中的鈣污染，在試劑中加入8-羥基喹嚀以去除鎂的干擾。為避免玻璃中的鈣離子溶出，鈣標準貯存液用塑料瓶保存。為提高分析結果的準確度，減少偶然誤差，應增加平行測定次數(shù)。本實驗所測結果為

37、唾液中總鈣濃度。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗七（2） 唾液中磷含量測定,目的和要求：了解分光光度法的定量原理，熟悉減少實驗誤差、提高準確度的方法和操作技術，掌握比色法測定唾液中磷含量的原理和方法。,實驗原理：,實驗內容： 1.收集口腔唾液； 2.測定唾液中總鈣含量。實驗設備和用品：,硫酸,還原,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗方法和步驟：,1. 標本收集及處理 收集非刺激性唾液0.5ml，取0.

38、2ml，加10%三氯 醋酸3.8ml，充分混勻，放置10min，3000r/min離心10min，取上清液備測。2. 測定 準備三組EP管，按表7-4順序分別加入試劑：,3. 結果計算 C唾液（mg/ml）=A樣品/A標準×C標準=A樣品/A標準×0.005(mg/ml),第二節(jié) 口腔生物化學實驗,注意事項：為了保證測試結果的可靠性，所有實驗器皿一定要清洗干凈 且用三蒸水多次沖洗

39、，烤干后待用。為了避免玻璃中的磷離子溶出，磷標準貯存液用塑料瓶保存。為了提高分析結果的準確度，減少偶然誤差，應增加平行測定次數(shù)。本實驗所測結果為唾液中總磷濃度。,思考題： 1. 唾液中磷含量測定誤差的種類有哪些？ 2. 含量計算的方法有哪些？,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗八 唾液分泌情況的測定,實驗目的與要求： 唾液分泌量及成分的測定對一些疾病診治效果的評估有重要意義。通過實習要求

40、掌握靜態(tài)流率和靜態(tài)流率的測量意義和方法，掌握單個腺體分泌測定的方法，為將來臨床研究奠定基礎。實驗內容： 1. 靜態(tài)唾液總流率的測定； 2. 動態(tài)唾液總流率的測定； 3. 單個腺體唾液分泌的測定。材料、用品及設備： 消毒的帶漏斗試管和普通試管，無菌棉球或棉墊，天平，色層分析紙，Lashley杯，0.1mol/L枸櫞酸(或1g膠姆，或方糖等)。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗方法：1.

41、 靜態(tài)唾液總流率測定 常用測定方法包括：吸取法(draining)：手持帶漏斗的試管，使唾液沿下唇逐漸流入試管，至結束時，受試者將口內剩余唾液全部吐入試管。通常收取15分鐘，計算單位時間的唾液量。吐取法(spitting)：使唾液在口底聚集，受試者每隔60秒將其吐入試管，一般收集10分鐘，低于1ml/10min為異常減低。吸引法(suction)：用負壓吸引器將唾液自口底持續(xù)吸入試管，吸引頭置于舌下。棉墊法(swab)：將

42、每個約0.24cm×0.6cm的棉墊預先稱重，置于口內各唾液腺導管開口處，收集后稱重。吐取法及吸取法相對常用，操作簡便，還可用于動態(tài)唾液總流率的測定。而吸引法和棉墊法會產生一定刺激，操作相對復雜，目前多不使用。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗方法：2. 動態(tài)唾液總流率測定 常用測定方法包括：酸刺激法：將0.1mol/L枸櫞酸滴于舌背前部，每次4滴，受試者將舌尖后卷，分泌唾液用吐取法收集一般測5分鐘～10分鐘。咀嚼

43、刺激法：將1g膠姆以每分鐘20次的頻率咀嚼10分鐘,低于10ml/10min為異常低下；或用5g醫(yī)用白蠟，溫水泡軟后咀嚼6分鐘，低于6ml/6min為異常低下。方糖法：取方糖1.5cm×1.5cm置于舌背上，勿動，正常情況下15分鐘～30分鐘方糖全部溶化，否則認為分泌功能低下。酸刺激法可能影響唾液的緩沖容量和pH等。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗方法：3. 動態(tài)唾液總流率測定 包括腮腺、下頜下腺與舌下腺的測定。常

44、用測定方法包括：腮腺唾液分泌測定：用Lashley杯吸附于頰黏膜的導管開口處，靜止腮腺流率變異較大，而酸刺激流率低于1ml/5min為異常低下。下頜下腺與舌下腺唾液分泌測定：因兩腺體常共同開口于口腔，所以測定分泌時常收集在一起，常用插管法和隔離法。小唾液腺唾液分泌測定：通常用色層分析紙收集，擦干局部黏膜后貼于黏膜2分鐘后，用濕度儀測其含水率。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,實驗報告與評定：靜態(tài)唾液總流率或動態(tài)唾液總流率，或單個腺體

45、分泌情況分析。思考題： 靜態(tài)唾液流率測定和動態(tài)唾液流率測定應該注意些什么？各應用于何種情況下？,注意事項：使用咀嚼法測定唾液腺分泌時不影響唾液成分，相對比較常用，但要注意保持恒定的咀嚼頻率。單個腺體唾液收集方法較復雜，且不能反映所有唾液腺總的分泌狀況，在評價整個唾液腺功能時有局限性，不過在測定唾液成分時因污染少而多采用此方法。,第二節(jié) 口腔生物化學實驗,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,實驗九 以釉原蛋白基因進行性別鑒定,實

46、驗目的與要求： 通過此實驗學會PCR檢測技術，包括DNA提取、分光光度計的使用、引 物設計的原則、PCR擴增的條件設定，以及電泳和測序結果分析等。實驗原理： 針對Amelogenin基因內含子1區(qū)x染色體上6bp缺失的特性，采用一對x、 Y同源引物擴增，男性個體同時得到x染色體Amelogenin等位基因特異 性段(簡稱Am X，106 bp或212 bp)和Y染色體Amelo

47、genin等位基因特異 性片段(簡稱Am Y，112bp或218 bp)，分型結果表現(xiàn)出兩條譜帶；而女 性僅有Am X(106 bp或212 bp)，分型表現(xiàn)為一條譜帶，因此鑒定性別。實驗內容：,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,實驗設備及器材：,5ml無菌試管（含肝素抗凝劑）；PowerPlex M16 system DNA提取試劑盒，Am 基因上游引物和下游引物，2×Taq PCR MasterMi

48、x；20bp DNA Ladder Marker；DNA片段快速純化試劑盒。,實驗方法：,樣品采集,采集靜脈血5ml于無菌抗凝管中,DNA 提取和含量檢測,,,性別鑒定,PCR 擴增、凝膠電泳、純化測序,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,實驗方法：,DNA 提取和含量檢測：,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,實驗方法：,性別鑒定——PCR 擴增、凝膠電泳、純化測序PCR 擴增：PCR反應引物序列如下：上游引物( 5‘- CCCTGG GC

49、T CTG TAA AGA ATA GTG-3’)，下游引物( 5‘-ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG－3’)；模板DNA為上述血液所獲樣品的DNA提取液。PCR 反應體系為25μL，其中2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，上下游引物( 1μmol /L)各1μl，無菌雙蒸水9.5μl，模板DNA 1μl。PCR 反應參數(shù): 95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，60℃退火3

50、0秒，72℃延伸30秒，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。凝膠電泳：制備濃度為3g/L的瓊脂糖凝膠，置1×TAE電泳緩沖液中，電泳條件為: 電壓100V，電泳時間120分鐘。電泳結果放入凝膠成像儀中進行觀察。純化測序：將瓊脂糖凝膠上的特異性條帶切下純化、回收、測序。,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,結果分析：,M-marker；1、2-陰性對照；3、5-女性；4-男性,實驗報告評定： PCR擴增后凝膠電泳和測

51、序結果分析評定。思考題： 1.PCR檢測分析技術中最重要的關鍵環(huán)節(jié)有哪些？ 2.PCR實驗中容易出問題的操作有哪些？應該如何避免？,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,注意事項：引物 引物是PCR反應的關鍵，其特異性取決于引物與模板DNA的互補程度。引物的長度最好為15bp～30bp；引物擴增跨度以200bp～500bp為宜，特定條件下可擴增長度至10kb的片段；其中G+C含量以40%～60%為宜，ATGC最好

52、隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物內部出現(xiàn)二級結構或兩條引物間互補，特別是3’端的互補；3’端的堿基，尤其最末及倒數(shù)第二個堿基應嚴格要求配對；引物中有或最好加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點；引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性；每條引物的濃度0.1μmol～1μmol或10pmol～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好。PCR 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增的程度

53、。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30次～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，但非特異性產物的量亦隨之增多。設立對照 PCR反應應設立陽性對照和陰性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要參考指標。,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗十 成骨細胞的分離培養(yǎng),實驗目的與要求： 掌握分離、培養(yǎng)和鑒定成骨細胞方法，了解成骨細胞的功能與

54、特性。實驗原理： 成骨細胞一個明顯特征是可形成礦化結節(jié)，故采用Von Kossa染色法對成骨細胞形成的礦化結節(jié)進行鑒定。實驗內容： 成骨細胞的收集、培養(yǎng)和鑒定。實驗主要設備與器材：,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗方法： 采用酶消化法無菌下分離獲取幼兔成額、頂骨→分離成骨細胞→體外培養(yǎng)成骨細胞→觀察、鑒定成骨細胞：形態(tài)、鈣化能力測定。,1. 成骨細胞的收集,出生十天內的大耳白兔清洗、75

55、%酒精浸泡消毒5分鐘→剪開皮膚后環(huán)行剪下顱骨(頂骨及額骨)→用含500U/ml青霉素、500 μg/ml 鏈霉素的無菌PBS液沖洗三次→用剪刀和鑷子剔除結締組織和血管→剪碎成1mm3大小→用0.25%胰蛋白酶37°C預消化20分鐘→加含0.2%的Ⅰ型膠原酶和0.1%的透明質酸酶消化（共消化5次，每次在37°C恒溫震蕩20分鐘） →取第3、4、5次消化的細胞懸液300g離心10分鐘→棄上清→沉淀的細胞用不含血清的α-M

56、EM培養(yǎng)基洗滌離心→用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸→吹打均勻后以1×105/ml密度接種到培養(yǎng)皿→置于37°C 、5%CO2培養(yǎng),第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),2. 成骨細胞的培養(yǎng)（1）24 小時后可見細胞貼壁生長，更換新鮮含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液。以后每隔48小時換液一次。（2）待細胞長滿至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶消化，使貼壁細胞消化松解、變圓后吸出消化液，加入含10

57、%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液終止消化。（3）輕輕吹打細胞，待其脫壁后調至相應的細胞密度，移入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)后的繼續(xù)實驗。3. 成骨細胞的鑒定（1）用倒置相差顯微鏡觀察成骨細胞形態(tài)及生長情況。 （2）茜素紅（Alizarin Red）染色觀察礦化結節(jié)（3）改良Gomori鈣鈷法——堿性磷酸酶(ALP)染色,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),結果分析：倒置顯微鏡下觀察：成骨細胞從球形、懸浮狀到梭形、三角形或多角形梭形

58、或鱗片狀，有較多突起逐漸可見基質堆積、結節(jié)、鈣化結節(jié)形成。礦化結節(jié)觀察：茜素紅染成橘紅色顆粒狀。ALP染色成骨細胞胞漿呈黑色。,鈣化結節(jié)茜素紅染色不同時間的變化,思考題：除茜素紅染色法外，還有什么方法可以鑒定獲得的細胞屬于成骨細胞？成骨細胞的功能與破骨細胞有關嗎？如何提高成骨細胞分離培養(yǎng)的成功率？,注意事項:2%硝酸鈣、2%硝酸鈷和1%硫化銨要用前新鮮配制。,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗十一 破骨細胞的分離培養(yǎng)

59、,實驗目的與要求： 破骨細胞是高度分化的多核巨細胞，是骨組織吸收時的功能細胞。通過本實驗，要求學會從幼年動物骨內分離和培養(yǎng)和觀察破骨細胞的基本技術，了解鑒定破骨細胞的主要方法。實驗原理： 已知機體的破骨細胞來源于單核-吞噬系統(tǒng)的骨髓干細胞，所以可以從機體年輕骨髓中分離獲得該細胞。實驗內容： 1. 從年幼的動物的長管骨或顱蓋骨分離破骨細胞； 2. 培養(yǎng)和觀察破骨細胞； 3. 破骨細胞的鑒定。

60、,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗方法：1. 分離破骨細胞取新出生的白兔5只用肥皂水洗滌三次→清水沖凈→斷頭處死→浸泡于75%乙醇中1分鐘→去皮分離股骨、肱骨、脛骨和顱蓋骨→置盛有60ml Hanks液的培養(yǎng)皿 →刮除軟組織及軟骨骺→置Hanks液洗2次→移入12ml含有抗生素的199培養(yǎng)液縱行剖開骨→以手術刀輕刮骨的內表面→用尖吸管反復吸取培養(yǎng)液沖洗骨髓腔內表面至色發(fā)白為止→靜置1分鐘，取懸液備用。,主要實驗設備與

61、器材：,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),2. 骨片制備將放至-70?C冰箱中儲存的牛股骨取出，在沖水降溫的條件下分切成6mm ×6mm×0.2mm大小的骨片，并用不同粗細的砂紙磨成10μm厚。將骨片置生理鹽水中于超聲波清洗器上處理5分鐘×3次。將超聲處理后的骨片浸入含抗生素的199培養(yǎng)液中浸泡5分鐘～10分鐘×3 次。3. 破骨細胞培養(yǎng) 取24孔板，孔內分別放入骨片和蓋玻片，并分

62、別加入1ml199培養(yǎng)液，置5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫預熱1小時。每孔加入0.5ml上述制備的細胞懸液，培養(yǎng)15小時～20小時后，吸去懸液，用199培養(yǎng)液沖洗未貼壁的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察骨片被吸收的情況，根據(jù)細胞生長、骨片吸收情況和實驗需要，決定培養(yǎng)終止時間。4. 破骨細胞鑒定 用倒置相差顯微鏡或電鏡觀察；酸性磷酸酶或降鈣素染色后鑒定。,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),4. 破骨細胞鑒定 （1）倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)破骨

63、細胞的形態(tài)； （2）HE染色：生長有細胞的蓋玻片分別于3天～7天取出，80%乙醇固定，HE染色，脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光鏡觀察； （3）甲苯胺蘭染色：將細胞蓋玻片置甲醇中固定10分鐘，1%甲苯胺蘭染色3分鐘，95%乙醇分色、蒸餾水沖凈，空氣干燥后二甲苯透明、樹膠封片，光鏡觀察； （4）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色進行破骨細胞鑒定：將細胞爬片置37℃溫箱中5分鐘干燥后，置2.5%的戊二醛中4℃固定10分鐘，然后用孵育液溫

64、育至37℃，雙蒸水洗3次，蘇木素復染2分鐘，自來水沖洗反藍，晾干、二甲苯透明、樹膠封固，光鏡觀察。,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),（5）破骨細胞骨吸收活動的觀察：甲苯胺蘭染色：培養(yǎng)的第7天取出培養(yǎng)板中的骨片，2.5%戊二醛固定7分鐘，于0.25mmol/L氫氧化銨中超聲清洗5分鐘×3次，系列酒精脫水，自然晾干，含1%硼酸鈉的1%甲苯胺藍染色3分鐘，自然晾干后光學顯微鏡下觀察。用掃描電鏡觀察破骨細胞在骨磨片上形成的

65、骨吸收陷窩：經破骨細胞培養(yǎng)至10天的骨片以0.25 mol/L氫氧化銨超聲處理10 分鐘，清除骨片上的破骨細胞，再以2.5%戊二醛固定、1%鋨酸固定、酒精系列脫水、 醋酸異戊酯置換酒精后，二氧化碳臨界點干燥、噴金后掃描電鏡觀察。,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),倒置相差顯微鏡可見骨片上破骨細胞吸收陷窩,破骨細胞TRAP染色胞漿呈紅色,結果分析與實驗報告評定：破骨細胞的分離培養(yǎng)與鑒定,注意事項:破骨細胞在體外具有形成骨吸收陷窩的

66、功能，但是由于其是終末分化細胞，不能分裂，故其分離、培養(yǎng)一般只能存活10天以內；可以觀察破骨細胞與骨片共培養(yǎng)后1天～10天內的不同時間的變化。由于破骨細胞的生活習性是貼壁生長，所以分離破骨細胞時，要使用胰蛋白酶進行消化，去除周邊的成纖維細胞，只留下貼壁的破骨細胞，才能使破骨細胞得以充分伸展和移動，也才能使其功能研究便于觀察。,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗目的與要求： 通過本實驗學習要求掌握用MTT法測定細

67、胞增殖活性的基本方法，學會使用酶標儀檢測吸光度，應用生物軟件或Excel繪制實驗結果圖，并了解解析結果的意義。實驗原理： 活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性藍紫色結晶甲瓚（formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀測定其在波長490nm處的吸收光值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定數(shù)量范圍內，100U/ml MTT結晶形成的量與活細胞數(shù)成正比。

68、實驗內容： MTT法測定不同濃度藥物如尼古丁對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖的影響； 用酶標儀檢測吸光度值； 應用生物軟件或Excel繪制實驗結果圖，解析結果的意義。,實驗十二 MTT法檢測細胞活性,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗主要設備和器材：,實驗方法：,第四節(jié) 骨組織生物學和口腔細胞培養(yǎng),實驗方法：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的口腔鱗狀細胞癌細胞Tca8113稀釋成2.5×104個 /ml后，接種于96孔板，每

69、孔200μl，置5%CO2、37?C恒溫培養(yǎng)24小時至細胞貼壁。吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度梯度的尼古?。?μM、0.01μM、0.1μM、1μM），每個濃度設置3個復孔，以0μM 者為陰性對照，置5%CO2、 37?C恒溫培養(yǎng)24小時后，每孔加入5mg/mlMTT試劑20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，錫紙包裹孔板15分鐘后，用酶標儀進行比色，讀取并記錄波長490nm下的每孔OD值。按照下式計算細