同步輻射晶體學(xué)衍射

1、同步輻射晶體學(xué)衍射,董宇輝BSRF，IHEP，CAS,什么是同步輻射？,接近光速運(yùn)動(dòng)的電子或正電子在改變運(yùn)動(dòng)方向時(shí)放出的電磁輻射，因?yàn)槭窃谕郊铀倨魃习l(fā)現(xiàn)的，所以稱為同步輻射。這種輻射強(qiáng)度高、覆蓋的頻譜范圍廣，可以任意選擇所需要的波長(zhǎng)且連續(xù)可調(diào)，因此成為一種科學(xué)研究的新光源。,同步輻射裝置示意圖,Booster,儲(chǔ)存環(huán),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,三種發(fā)光元件,彎轉(zhuǎn)磁鐵,扭擺器(Wiggler),波蕩器(und

2、ulator),同步輻射的作用,同步輻射的加入，大大提高了結(jié)構(gòu)測(cè)定的速度。,PDB(Protein Data Bank),同步輻射促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析,1980-1990年，獲得解析的蛋白質(zhì)數(shù)量大幅度增加；1980左右，同步輻射開始應(yīng)用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中，1990年各種技術(shù)趨于成熟，同步輻射大規(guī)模應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)解析。,SR vs NMR,80%以上的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由同步輻射晶體學(xué)衍射方法解析；大約15%的結(jié)構(gòu)由NMR（核磁共振）

3、方法得到；同步輻射解析結(jié)構(gòu)所占的份量在不斷的增加。,生物學(xué)家的評(píng)論,生物大分子結(jié)構(gòu)測(cè)定影響了生物學(xué)幾乎所有的領(lǐng)域。幾乎每個(gè)星期都有激動(dòng)人心的結(jié)構(gòu)發(fā)表在如Science和Nature這樣的雜志上。生物大分子晶體學(xué)已經(jīng)比其他任何學(xué)科更多地得益于同步輻射的應(yīng)用。 ------Steven E. Ealick, Cornell Univ.,生物大分子晶體,衍射能力很弱：大部分原子為C、N、O、S；晶體質(zhì)量差；相位問題解

4、決困難。,同步輻射的高亮度、準(zhǔn)直性好、能量可調(diào)正好提供了適合的光源,為什么要使用同步輻射,高亮度：衍射弱的晶體可以得到好的信號(hào)；準(zhǔn)直性好：質(zhì)量差的晶體可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；能量可調(diào)：可以進(jìn)行多波長(zhǎng)反常衍射實(shí)驗(yàn)（解決全新結(jié)構(gòu)的有效方法）。,衍射數(shù)據(jù),MR: CNS,CCP4,SIR/MIR/SAD/MAD：Solve/Resolve, shelxd,SnB, CNS, Hyss, OASIS,CCP4,sharp,,數(shù)據(jù)處理：HKL

5、2000，Automar, mosflm, XDS,建模：ARP/wARP，ResolveO, Xtalview,模型修正：CNS,模型檢驗(yàn)：CNSCCP4,解析結(jié)構(gòu)的流程,,,,,,,收集衍射數(shù)據(jù)的目的,確定出準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)因子F(hkl)。,收集單晶衍射數(shù)據(jù)的方法,回?cái)[法：最常用旋進(jìn)法魏森堡法,,回?cái)[法：rotation (oscillation) method,,,,,,,,,,,,,入射X光,單晶,繞某個(gè)軸旋轉(zhuǎn),

6、探測(cè)器（CCD、IP）,,,,,,,,,晶體的安裝方式,,,,,毛細(xì)管：無法冷卻,loop：冷卻,蛋白質(zhì)晶體的衍射,單晶樣品冷凍,使用液氮冷卻的干燥空氣（防止結(jié)冰）來冷凍樣品。實(shí)踐證明可以大大延長(zhǎng)蛋白質(zhì)晶體耐受同步輻射輻照的時(shí)間。對(duì)于花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)（如MAD）是必不可少的。一般用100K的溫度就可滿足要求。,收集衍射數(shù)據(jù)的策略,是否需要冷凍？為了減少輻射衰減，需要冷凍。但是冷凍可能導(dǎo)致晶體損壞，往往需要防凍劑（有些晶體生長(zhǎng)時(shí)使

7、用的沉淀劑本身就有防凍效果）。防凍劑需要嘗試。（花費(fèi)大量時(shí)間和精力的工作?。┎灰茐木w，不出現(xiàn)冰的衍射（不結(jié)冰）。,選取冷凍條件,可能晶體本身就有抗凍能力。安裝晶體時(shí)盡量減少（生長(zhǎng)晶體所用的）母液。最簡(jiǎn)單的方法：把母液中部分水替換成甘油或蔗糖。先找出沒有結(jié)冰的替換條件，再嘗試晶體是否不被破壞。使用Hampton提供的防凍劑。使用礦物油。,是否為需要的蛋白晶體,生長(zhǎng)出來的晶體可能是其他成分，特別是結(jié)晶所使用的小分子試劑的晶

8、體（鹽晶）。在衍射上可以判斷：蛋白質(zhì)晶體晶胞很大，起碼有幾十埃，衍射點(diǎn)很多，鹽晶最大只有十幾埃，衍射點(diǎn)很少。蛋白晶體偏光弱，感覺很軟（像果凍）；鹽晶偏光強(qiáng)，感覺很硬（像鹽粒）。,晶體的單晶性,如果要順利的解析出結(jié)構(gòu)，晶體的單晶性要好；仔細(xì)觀察衍射點(diǎn)的形狀和衍射的上限：衍射點(diǎn)要圓而銳利，能達(dá)到的衍射上限不要低于3埃，否則結(jié)構(gòu)解析就難了。出現(xiàn)兩個(gè)點(diǎn)很靠近的情況要小心：這可能不是單晶（孿晶），也會(huì)是晶胞某個(gè)軸特別長(zhǎng)（移動(dòng)探測(cè)器距離，處

9、理一下衍射圖）。一定要排除孿晶的可能性。,適合衍射的晶體,得到適合衍射的晶體是一件相當(dāng)花費(fèi)時(shí)間和精力的任務(wù)。首先要得到大量的純凈蛋白質(zhì)（分子生物學(xué)表達(dá)重組蛋白，生化手段純化）；尋找可能的結(jié)晶條件：如用Hampton公司的篩選試劑盒Index，Screen I和Screen II。,,優(yōu)化結(jié)晶條件：可能優(yōu)化的條件很多，如沉淀劑濃度，鹽濃度，離子強(qiáng)度，pH值，蛋白濃度等等等等。得到大量的、衍射能力好的晶體。篩選合適的防凍劑。每一步

10、都可能遇上困難。,探測(cè)器距離的設(shè)置,距離近可以收集到的衍射分辨率高，但是衍射點(diǎn)可能重疊（overlap）；距離遠(yuǎn)可以使信噪比提高，衍射點(diǎn)分辨得好，但是能收集的分辨率降低。經(jīng)驗(yàn)：晶體中最長(zhǎng)的晶胞長(zhǎng)度數(shù)值（以埃為單位）=晶體到探測(cè)器距離數(shù)值（以毫米為單位）?；蛘咛綔y(cè)器最外面正好達(dá)到衍射分辨率上限。高、低分辨率數(shù)據(jù)可能要分別收集（如果晶體分辨率極高）。,回?cái)[角度、畫面張數(shù)、曝光時(shí)間,回?cái)[角度一般取1度。但是晶胞很大的情況下需要減少角度

11、。不要出現(xiàn)回?cái)[角度過大導(dǎo)致衍射點(diǎn)重疊。需要收集的畫面張數(shù)取決于晶體的對(duì)稱性，至少要覆蓋一個(gè)獨(dú)立衍射區(qū)。當(dāng)然在時(shí)間許可的情況下，越多越好。曝光時(shí)間取決于晶體衍射能力，盡量使探測(cè)器的動(dòng)態(tài)范圍得到利用，也要考慮晶體的輻射耐受能力。,波長(zhǎng)選擇,波長(zhǎng)越長(zhǎng)，衍射強(qiáng)度會(huì)大（~l3）；但是吸收效應(yīng)不好處理。同步輻射上還是需要較短的波長(zhǎng)，除非反常衍射需要調(diào)節(jié)特定的波長(zhǎng)。一般的束線能量?jī)?yōu)化在1埃左右，選擇最優(yōu)強(qiáng)度的波長(zhǎng)最好。短的波長(zhǎng)使得衍射點(diǎn)間距

12、減少，可以考慮探測(cè)器距離加大一些。,晶體尺寸和外形,同步輻射由于強(qiáng)度高，不需要大的晶體。其實(shí)太大的晶體不容易冷凍。一般100-200微米即可。好看的晶體衍射不一定好：衍射說了算。,安裝晶體的方位,一般不需要考慮：由于處理技術(shù)的發(fā)展，隨機(jī)取向的晶體就可以了。選擇特殊取向可以減少衍射盲區(qū)（即收集不到的衍射點(diǎn)區(qū)域），但是也會(huì)導(dǎo)致盲區(qū)增加。有時(shí)候反常衍射需要選擇特殊的取向。除非有精確調(diào)節(jié)晶體取向的衍射儀（三圓衍射儀），一圓衍射儀是隨機(jī)取向

13、裝樣的。經(jīng)驗(yàn)表明，一旦晶體取向的某個(gè)軸和入射光太接近，會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)處理困難。,相位問題的解決,,解決相位問題的主要方法,同晶差值付里葉法分子置換法同晶置換法反常衍射法,反常衍射,如果得到的晶體中含有重金屬（蛋白本身含有、硒代引入、浸泡重元素引入的都可以），采集數(shù)據(jù)時(shí)就可以考慮作反常衍射。現(xiàn)在利用單波長(zhǎng)反常衍射（SAD）解析結(jié)構(gòu)的數(shù)目已經(jīng)接近或超過MAD。所以多數(shù)情況下一個(gè)波長(zhǎng)的反常衍射已經(jīng)足夠了。,MAD,選擇吸收邊附近的幾個(gè)波長(zhǎng)

14、，相當(dāng)于幾個(gè)不同的完全同晶的置換。分子生物學(xué)提供了硒代的手段，對(duì)于解析全新結(jié)構(gòu)非常有利。,波長(zhǎng)選擇,,,,,,,,,f1,f2,f3,f4,四個(gè)波長(zhǎng),f1：peak，f’’最大；f2：inflection，f’最大；f3：high energy remote；f4：low energy remote。流行做法：一邊收集數(shù)據(jù)，一邊解析結(jié)構(gòu)。一般完成f1數(shù)據(jù)的收集，進(jìn)行f2數(shù)據(jù)收集時(shí)就完成相位解析了。,數(shù)據(jù),同晶置換：I_nati

15、ve（native晶體的衍射強(qiáng)度），I_h（同晶置換晶體的衍射強(qiáng)度）；反常衍射：I+，I-（Friedel對(duì)的強(qiáng)度）。,尋找重原子位置,同晶置換法得到的晶體可以看成在原有的晶胞內(nèi)的原子（位置在xi，yi，zi，一共N個(gè)）外，加入了某些重原子（位置在xhj，yhj，zhj，一共M個(gè)）。,AB*，A*B由于重原子和其他原子之間位置沒有相干關(guān)系，這一項(xiàng)求和的結(jié)果接近于零。所以IH-Inative主要是重原子的貢獻(xiàn)。通過差值patterso

16、n圖可以得到重原子位置，然后根據(jù)F的關(guān)系求出native的相位來。,,反常衍射也是類似處理：I+和I-主要是反常散射原子的貢獻(xiàn)。得到反常散射中心的位置后，在求解相位。反常衍射可以看作完全同晶的置換。,總結(jié)：,同晶置換和反常衍射解相位的一般步驟：差值Patterson圖尋找重原子；精修重原子位置；解出相位。Solve：自動(dòng)化較好的程序，以上步驟自動(dòng)完成；CNS：需要一步一步來進(jìn)行。,S vs M,單對(duì)同晶置換或者單波長(zhǎng)反常衍

17、射都存在相位雙解問題。以前是利用多對(duì)同晶置換或者多波長(zhǎng)反常衍射解決的?，F(xiàn)在通過與直接法的結(jié)合，不需要這么做了。直接法可以計(jì)算出兩個(gè)解的概率，選取概率大的那個(gè)作為真實(shí)解。,,Solve：雙解中利用sim概率選一個(gè)可能性較大的解，得到電子密度圖后，利用溶劑平滑改善。OASIS：再加上cochran概率，選取的解更接近真實(shí)解，其結(jié)果比solve好。,例子：Se-MAD,大腸桿菌（escherichia coli，E. coli）的巰基化

18、酶II（thioesterase ii）。Se-MAD收集了peak，inflection，low energy remote，high energy remote的數(shù)據(jù)，分辨率為2.5A。利用solve解決相位問題。,solve/resolve軟件包,由LANL的Tom Terwilliger開發(fā)的解析SAD/MAD/SIR/MIR的軟件包。運(yùn)行方式：編輯一個(gè)script（腳本），里面包含了需要讀入的數(shù)據(jù)文件，格式，需要進(jìn)行的運(yùn)

19、算等。,script,#!/bin/csh -f#setenv CCP4_OPEN UNKNOWNsetenv SOLVEDIR /usr/local/lib/solve#solve solve.logtitle 4-wavelength MAD dataset ! a title for this dataset @solve.setup ! get o

20、ur standard information read in logfile mad.logfile ! write out most information to this file. ! summary info will be written to "solve.prt&q

21、uot; mad_atom se ! the anomalously scattering atom is selenium refscattfactors ! do not refine scattering factors (you can if

22、 ! you want as long as the data is good) readdenzo ! data is from scalepack. Note: for best results] ! use "no merg

23、e original index" in scalepack] ! Alternative to "readdenzo" is "readformatted"] premerged ! data have not been

24、merged to the asymm unit] ! Alternative to "unmerged" is "premerged"],script,lambda 1 ! info on wavelength #1 follows label Pea

25、k Wavelength ! a label for this wavelength rawmadfile ../jia_peak.sca ! datafile for lambda 1 ; raw Intensities wavelength 0.9787 ! wavelength value fprimv_mad -5.9 ! f' v

26、alue at this wavelength fprprv_mad 4.1 ! f" value at this wavelength 四個(gè)波長(zhǎng)的數(shù)據(jù)都輸入。f’和f’’的值不用很準(zhǔn)確，solve會(huì)擬合這兩個(gè)值。,script,nres 570 !approx # of residues of protein in asymmetric unit] n

27、anomalous 8 !approx # of anomalously scattering atoms in a.u.] SCALE_MAD ! read in and localscale the data ANALYZE_MAD ! run MADMRG and MADBST and analyze all the Pattersons SOLVE

28、 ! Solve the structure Exit這里告訴solve程序的內(nèi)容包括晶體的空間群（在solve.setup中），數(shù)據(jù)格式（denzo處理的數(shù)據(jù)，已經(jīng)scale過了），數(shù)據(jù)文件名，蛋白中的氨基酸數(shù)目，反常散射原子數(shù)目等。然后運(yùn)行solve。,結(jié)果：重原子位置,---TOP SOLUTION FOUND BY SOLVE ( = 0.56; score = 48.66) ---

29、X Y Z OCCUP B HEIGHT/SIGMA 1 0.239 0.094 0.150 0.536 19.1 27.6 1 0.807 0.423 0.156 0.612 25.4 28.3 1 0.244 0

30、.080 0.098 0.689 32.4 28.1 1 0.800 0.433 0.102 0.646 30.2 27.9 1 0.156 0.410 0.243 0.669 36.3 24.4 1 0.198 0.118 0.251

31、 0.619 36.5 24.4 1 0.613 0.461 0.185 0.771 43.3 24.9 1 0.428 0.060 0.182 0.724 35.9 24.5 TIME REQUIRED TO OBTAIN THIS SOLUTIO

32、N: 33 MIN,重原子結(jié)構(gòu)雙解,通過Patterson函數(shù)得到的重原子（反常散射原子）結(jié)構(gòu)是雙解：真實(shí)解和對(duì)映體的解。（如在solve得出的另一個(gè)文件solve_inverse.xyz）。解決方法是分別給予這兩個(gè)重原子結(jié)構(gòu)計(jì)算相位，比較電子密度圖，符合程度好的那個(gè)即為正確解。CCP4中的程序abs也可以解決這個(gè)問題。,相位,相位包含在輸出的文件solve.mtz中。計(jì)算的細(xì)節(jié)輸出在一個(gè)log文件中，一般設(shè)為solve.lo

33、g（用戶定義）。,其他軟件,shelxd，sharp，CCP4，CNS都可以做同樣的工作。里面涉及的計(jì)算方法非常多，很難判斷那個(gè)方法更好，往往需要在不同階段使用不同軟件。目前最好的應(yīng)該是OASIS 2004。,相位改進(jìn)：phase improvement,無論是MR，還是MIR/SIR，MAD/SAD，初始的相位還是很粗糙的。需要做相位改進(jìn)。溶劑平滑（solvent flattening）是最有效的方法之一。CCP4的dm程序，r