生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)

1、62應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)摘要蛋白質(zhì)的可逆磷酸化具有重要的生物學(xué)意義，對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析有助于闡明蛋白質(zhì)磷酸化的機(jī)制與功能。生物質(zhì)譜是目前進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化分析最有力的方法之一。我們用天然磷酸化蛋白建立了中性丟失掃描和固相金屬親和色譜（IMAC）兩種基于質(zhì)譜的磷酸化蛋白分析方法。應(yīng)用這兩種方法均可將從蛋白質(zhì)酶切混合物中找出磷酸化肽段，進(jìn)而通過(guò)序列分析定位磷酸化位點(diǎn)。兩種方法具有不同的特點(diǎn)及

2、局限性，具體研究中還要視具體情況優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。蛋白質(zhì)可逆磷酸化是最普遍、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM）。在哺乳動(dòng)物中大約有三分之一的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是磷酸化修飾的，對(duì)眾多生物化學(xué)功能起開(kāi)關(guān)調(diào)控作用，是一種普遍的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著非常重要的作用。蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)重要方面就是蛋白質(zhì)磷酸化修飾的分析鑒定。目前沒(méi)有一個(gè)自動(dòng)測(cè)序方法能夠?qū)θN主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化絲氨基酸（pSer）、磷酸化蘇氨基酸（pT

3、hr）和磷酸化酪氨酸（pTyr）。毛細(xì)管電泳（CE）可以分析蛋白質(zhì)或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鑒定蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)首先要用高效液相色譜（HPLC）分離蛋白的酶解肽段，然后用CE篩測(cè)磷酸化肽，最后用自動(dòng)Edman降解氨基酸分析法確定其磷酸化位點(diǎn)，工作量大，不是快速和高通量分析方法。生物質(zhì)譜（MS）是揭示蛋白質(zhì)許多翻譯后修飾和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析的一個(gè)不可缺少的工具，所用的蛋白質(zhì)樣品量在fmol水平。是唯一能夠與蛋白質(zhì)組研究水平相匹配的

4、方法。近年來(lái)，生物質(zhì)譜的發(fā)展顯著地促進(jìn)了對(duì)具有生物學(xué)功能的磷酸化蛋白質(zhì)的研究，是國(guó)際上當(dāng)前最重要的一個(gè)前沿領(lǐng)域，也是目前蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)重要方面。這種方法的成功建立，將使人們對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的研究跨上一個(gè)新的臺(tái)階，對(duì)功能性蛋白的尋找和作用機(jī)制探尋具有重要意義，在國(guó)內(nèi)具有廣泛的需求。但由于一起條件等限制，國(guó)內(nèi)此方面的報(bào)道還不多。我們用天然磷酸化蛋白建立了中性丟失掃描和固相金屬親和色譜（IMAC）兩種基于質(zhì)譜的磷酸化蛋白分析方法。中性丟失掃

5、描法具有很高的靈敏度，檢測(cè)限在fmol級(jí)。固相金屬親和色譜（IMAC）法是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的特異性富集磷酸化肽段的方法，該方法適用于微量復(fù)雜樣品的處理。目前微量IMAC預(yù)裝柱ZipTipMC已經(jīng)商品化，可以方便的與Nanospray微量分析系統(tǒng)相匹配。這兩種方法的建立和成熟運(yùn)用將為磷64推倒出肽段序列。Nanoflowprobe進(jìn)樣毛細(xì)管電壓為3000v。所有測(cè)定均在正離子方式下進(jìn)行，用Glufib(sigma)的串聯(lián)質(zhì)譜碎片校正，質(zhì)量

6、準(zhǔn)確度0.2Da。。中性丟失掃描：設(shè)定掃描范圍400－2000，掃描方式為中性丟失掃描，尋找中性丟失49的雙電荷離子?；|(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀為Bruker公司的Autoflex，將樣品溶于0.1%TFA中，取1μL與飽和CCA基質(zhì)上清液混合，取1L點(diǎn)在Scce384靶上，送入離子源中進(jìn)行檢測(cè)。反射檢測(cè)方式；飛行管長(zhǎng)2.5m；氮激光器：波長(zhǎng)337nm；加速電壓25KV；檢測(cè)電壓1.6KV；反射電壓23KV。校正用Peptid

7、eCalibrationStard(Bruker)。二、結(jié)果與討論二、結(jié)果與討論1、中性丟失掃描：1μL1μgμLβcasein酶解混合物用50％乙腈／水溶液稀釋為100μL（約500fmolμL）注射泵進(jìn)樣，正離子中性丟失掃描模式掃描中性丟失49的雙電荷離子（圖1）。掃描得到一質(zhì)荷比為1031.50的雙電荷峰。圖1：上半部分為中性丟失：上半部分為中性丟失49掃描的離子流色譜圖，下半部分為掃描總離子流色譜圖。掃描的離子流色譜圖，下半部分