純化細(xì)胞的方法

1、細(xì)胞純化,,細(xì)胞純化方法分類,自然純化人工純化,,自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，在長(zhǎng)期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞，最后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。留下的細(xì)胞：成纖維細(xì)胞、突變細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞 缺點(diǎn)：（1）無法按需要和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇細(xì)胞（2）花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),一、自然純化,1、細(xì)胞因子依賴純化法,是通過加入某些特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系.人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需

2、要有特殊的細(xì)胞因子存在的環(huán)境才能長(zhǎng)期存活和生長(zhǎng)繁殖,如白細(xì)胞介素-2（IL-2）SHI 他細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的細(xì)胞因子,B細(xì)胞生長(zhǎng)因子是B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖,形成IL-2依賴的T細(xì)胞,如CTLL-2細(xì)胞系,而其他細(xì)胞則自然被淘汰,采用此法還建立了IL-6依賴的細(xì)胞系,如B9、CTD7細(xì)胞系.,二、人工純化,人工純化是利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件,抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化

3、細(xì)胞的目的.主要有以下6種方法.1.細(xì)胞因子依賴純化法2.酶消化法3.機(jī)械刮除法 4.反復(fù)貼壁法5.離心分離法 1、速度沉降分離法 2、等密度梯度沉降分離法6.單細(xì)胞克隆培養(yǎng),2、酶消化法：,酶消化法是比較常用的純化方法,不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行,能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,是兩者分開,達(dá)到純化的目的；另外對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁細(xì)胞及黏附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的.,上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化

4、：,兩者在胰蛋白酶的作用下,由于成纖維細(xì)胞先脫壁,二上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁,特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開,方法步驟如下. 采用常規(guī)消化傳代方式將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次,每次加1ml（25ml培養(yǎng)瓶）,來回輕搖1-2次,使胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面,然后倒掉. 蓋好瓶塞,將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞變園,部分脫落

5、,立即加入2ml有血清的培養(yǎng)基終止消化. 用彎頭吸管輕輕吹打成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域（可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào)）.吹打時(shí)不要用力,也不要吹打上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域.吹打結(jié)束后,再用少量培養(yǎng)基漂洗一遍,然后加入適量培養(yǎng)基于瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng),也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次. 隔幾日后或下次傳代時(shí),再進(jìn)行上述操作,進(jìn)過幾次處理,就可將成纖維細(xì)胞去除或者將兩者分開.,3、機(jī)械刮除法：,原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為區(qū)成混雜生

6、長(zhǎng),每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上.可采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域,其方法步驟如下 將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶,在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行操作. 用硅橡膠刮子在不需要生長(zhǎng)的細(xì)胞區(qū)域推劃,使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中,注意不要傷及所需細(xì)胞. 推劃后用培養(yǎng)基沖洗振搖兩次倒掉,即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng), 數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長(zhǎng)出,可再進(jìn)行上述操作,這樣反復(fù)多次可以純

7、化細(xì)胞.操作過程中要嚴(yán)格無菌操作,防止污染.,4、反復(fù)貼壁法：,成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比,其貼壁過程快,大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)（大約10-30min）完成附著過程（但不一定完全伸展）,而上皮細(xì)胞（大部分）在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定,稍加振蕩即浮起,利用此差別可以純化細(xì)胞. 將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)培養(yǎng)內(nèi)（最好培養(yǎng)基內(nèi)不含血清,此時(shí)上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置20min. 在倒置顯微鏡下觀察,見部分細(xì)胞貼壁,稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí),

8、將細(xì)胞懸液導(dǎo)入另一培養(yǎng)瓶中. 繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min,然后重復(fù)上述操作后,即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開,在第一瓶和第二瓶以成纖維細(xì)胞為主,往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主,下次傳代時(shí)再按上述方法處理,就可使兩者達(dá)到完全分開的目的.,5、電烙篩選法,在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí),往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶,轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集、排列規(guī)則,有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì),與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限,此時(shí)即可用機(jī)械刮除法取出未轉(zhuǎn)化細(xì)胞,也可用電

9、烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞. 倒去舊液,并用記號(hào)筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域. 用加熱的微型電烙器（類似焊接用的電烙鐵）將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死,只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞.在單細(xì)胞克隆篩選時(shí),也可用此法將單個(gè)細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死. 然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng),即可達(dá)到純化的目的.,單細(xì)胞培養(yǎng)（克隆培養(yǎng)）,有限稀釋法將需要再克隆的細(xì)胞株自培養(yǎng)孔內(nèi)吸出并作細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)出1mL的細(xì)胞數(shù)。用培養(yǎng)液稀釋， 使細(xì)胞

10、濃度為50～60個(gè)/mL，于96孔培養(yǎng)板中每孔加0.1mL(五六個(gè)細(xì)胞/孔)。接種2排，剩余細(xì)胞懸液用HT培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排，如此類推，直至使每孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)7～10d后，選擇單個(gè)克隆生長(zhǎng)的陽性孔再一次進(jìn)行克隆。一般需要如此重復(fù)3～5次，直至達(dá)100%陽性孔率時(shí)即可，以確?？贵w由單個(gè)克隆所產(chǎn)生。,,（1）取出抗體陽性孔細(xì)胞，用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。（2）用培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成200個(gè)/ml、40個(gè)/ml、20個(gè)/ml