質(zhì)粒的轉化(熱激法)

1、實驗四質(zhì)粒的轉化質(zhì)粒的轉化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞中，實現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。實驗目的：掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞及轉化子的鑒定方法。實驗材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細胞。實驗原理：（1）熱激法：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合

2、物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉化子。（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔DNA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。熱激法轉化實驗步驟：1制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化

3、的250mlLB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μgml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2取出1管制備好的感受態(tài)細胞，放在冰上融化；3每100μl感受態(tài)細胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；4熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；5冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉移至冰浴，放置1－2分鐘；6復蘇：每管加400μlLB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；7布皿：取適當

4、體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；8培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時即可觀察到白色的菌落，即為轉化子。實驗四質(zhì)粒的轉化質(zhì)粒的轉化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)細胞中，實現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作。可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。實驗目的：掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞及轉化子的鑒定方法。實驗材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細胞。實驗

5、原理：（1）熱激法：大腸桿菌在0℃CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉化子。（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔D

6、NA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。熱激法轉化實驗步驟：1制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250mlLB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μgml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2取出1管制備好的感受態(tài)細胞，放在冰上融化；3每100μl感受態(tài)細胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；4熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；5冰鎮(zhèn)：快速將離