分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)——目的基因的克隆及表達(dá)

1、1分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)——目的基因的克隆及表達(dá)目的基因的克隆及表達(dá)第一節(jié)基因操作概述..............................................................................................................2一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)...............................................

2、..............................................2二、質(zhì)粒概述....................................................................................................................4三、凝膠電泳............................................

3、........................................................................5四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化........................................................................6五、重組質(zhì)粒的連接................................................

4、........................................................7六、限制性內(nèi)切酶消化....................................................................................................7七、SDSPAGE蛋白質(zhì)電泳......................................

5、.....................................................7第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑......................................................................................................7一、材料................................................

6、............................................................................8二、設(shè)備............................................................................................................................8三、試劑：.........

7、...............................................................................................................9第三節(jié)操作步驟.....................................................................................................

8、...............10一、目的基因的獲得：..................................................................................................10二、pET21bT（pET21bR、pET21b）載體的獲得：..............................................11三、pET21b等與目的片段

9、的連接作用......................................................................12四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行陽(yáng)性克隆子篩選與鑒定.............................................13五、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21plyst，搖菌進(jìn)行SDSPAGE電泳。.............................14六、融合蛋白的

10、毒力測(cè)定..............................................................................................16第四節(jié)本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告....................................................................................................1634、模板：P

11、CR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好)。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102～105個(gè)拷貝，對(duì)于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。擴(kuò)增多拷貝序列時(shí)，用量更少。靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞，一根頭發(fā)，一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DN

12、A中分析目的序列。模板量過(guò)多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。5、TaqDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期為92.5℃130min，95℃40min，97℃5min?，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長(zhǎng)時(shí)間。TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmolLdNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率，一般

13、PCR中出錯(cuò)率為2104核苷酸每輪循環(huán)。在100μlPCR反應(yīng)中，1.5～2單位的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p。酶量過(guò)多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加，過(guò)少則使產(chǎn)量降低。6、反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10～50mmolLTrisCl(20℃下pH8.3～8.8)，50mmolLKCl和適當(dāng)濃度的Mg2。TrisCl在20℃時(shí)pH為8.3～8.8，但在實(shí)際PCR反應(yīng)中，pH為6

14、.8～7.8。50mmolL的KCl有利于引物的退火。另外，反應(yīng)液可加入5mmolL的二硫蘇糖醇(DDT)或100μgml的牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性。（二）、PCR反應(yīng)參數(shù)1、變性：在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入TaqDNA聚合酶(hotstart)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不完全，往往使PCR失敗，

15、因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時(shí)間為94℃1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?、退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成，引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度。實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5℃。一般當(dāng)引物中GC含量高，長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高