弗氏鏈霉菌s.fradiaes221角蛋白酶基因的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

1、．王89 6 9 3 ‘A t h e s i s ( d i s s e r t a t i o n ) s u b m i t t e d t oZ h e n g z h o u U n i v e r s i t yf o r t h eD e g r e e o f M a s t e rS t u d y o n H e t e r o g e n o u s l y E x p r e s s i o no f k e r

2、 a t i n a s ef r o m S ．f r a d i a eS - 2 2 1a n d C h a r a c t e ro f t h eK e r a t i n a s eB y M i n g z h u L iS u p e r v i s o r ：P r o f ．Y a n p i n g W a n gB i o p h y s i c sB i o —E n g i n e e r i n gD e

3、 p a r t m e n tM a y 2 0 1 0摘要摘要本文主要研究了來源于弗氏鏈霉菌＆f r a d i a eS ．2 2 1 的角蛋白酶基因的克隆和表達(dá)及蛋白酶純化、酶學(xué)性質(zhì)和酶底物切點(diǎn)的分析。l 、角蛋白酶基因在大腸桿菌和變鉛青鏈霉菌＆l i v i d a n s T K 2 4 中的表達(dá)。其中。去除鏈霉菌外分泌信號(hào)肽( 3 8 a a ) 編碼區(qū)的角蛋白酶原序列的基因命名為卿，其在大腸桿菌的表達(dá)中以包含體的形式存在

4、；而角蛋白酶成熟酶( 1 9 1 a a ) 帶有一段N 端前導(dǎo)肽( 7 8 a a )以及鏈霉菌外分泌信號(hào)肽( 3 8 a a ) 的基因命名為枷，其在變鉛青鏈霉菌＆l i v i d a n sT K 2 4 中獲得成功表達(dá)。2 、s t i e s 基因獲得成功表達(dá)后，該異源表達(dá)的角蛋白酶通過硫酸銨沉淀、陰離子交換柱和分子篩技術(shù)獲得純化，純化后的蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳( S D S ．P A G E ) 驗(yàn)證其分子量約為1 9

5、．1 k D a 。該純化蛋白經(jīng)B C A 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，其濃度約為2 7 ．3 9 9 ／m l 。3 、在p H 9 ．0 的嘣s ．H C I 緩沖液中，純化后的角蛋白酶其最適反應(yīng)溫度為3 7 “ ( 3 ，并能被絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟( P M S F ) 抑制，進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)獲得的角蛋白酶為絲氨酸蛋白酶家族；另外，其降解天青角蛋白的活性在／J I A - - 硫蘇糖醇( D D T ) 后有極大提高，D

6、D T能夠使已發(fā)生聚集的晶體蛋白發(fā)生分子之間的二硫鍵解離，從而為角蛋白酶降解天青角蛋白底物提供了方便。同時(shí)，在酶活性方面的研究中，酪蛋白、彈性蛋白、綠色熒光蛋白( G F P ) 和天青角蛋白作為可被降解的底物。4 、為了進(jìn)一步進(jìn)行底物酶切位點(diǎn)的研究，綠色熒光蛋白和酪蛋白被角蛋白酶降解后，其降解的肽段通過L C ．M S Q T O F 技術(shù)分析。該角蛋白酶可能沒有特異性的酶切位點(diǎn)，而是把底物切成肽段， 該現(xiàn)象展示了此蛋白酶新的酶切方式