分子生物學(xué)檢測技術(shù)概述

1、1分子生物學(xué)檢測技術(shù) 分子生物學(xué)檢測技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得巨大進(jìn)步的結(jié)晶，是在人們對基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)和調(diào)控等生命本質(zhì)問題的認(rèn)識(shí)日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。近年來，分子生物學(xué)診斷技術(shù)的方法學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，先后建立了限制性內(nèi)切酶酶譜分析、核酸分子雜交、限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析等方法。1985 年由美國 Cetus 公司人類遺傳學(xué)研究室 Mullis 等創(chuàng)立并隨后迅速發(fā)展起來的 DNA 體外擴(kuò)增

2、技術(shù)（Polymerase Chain Reaction, PCR） ，以及 90 年代發(fā)展起來的 DNA 芯片技術(shù)（DNA Chip） ，又將分子生物學(xué)診斷技術(shù)提高到一個(gè)嶄新的階段。一、 一、 核酸分子雜交 核酸分子雜交（一）概述：具有一定互補(bǔ)序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補(bǔ)配對原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程叫核酸分子雜交。應(yīng)用該技術(shù)可對特定 DNA 或 RNA 序列進(jìn)行定性或定量檢測。到目前為止，分子雜交技術(shù)在基因診斷中仍占重

3、要地位，它按反應(yīng)支持物可分為固相雜交和液相雜交兩種，前者應(yīng)用較廣，有 Southern印跡雜交、點(diǎn)雜交、夾心雜交（三明治雜交） 、原位雜交和寡核苷酸探針技術(shù)等。核酸分子雜交主要涉及兩個(gè)方面：待測的 DNA 或 RNA，以及用于檢測的DNA 或 RNA 探針。探針標(biāo)記的好壞決定檢測的敏感性。1、Southern 印跡雜交 是最經(jīng)典和應(yīng)用最廣泛的雜交方法。 根據(jù)基因探針與待測 DNA 限制酶酶解片段雜交的帶譜，可以直接確定宿主基因的缺陷

4、所在或病原體的存在狀態(tài)。3光檢測核酸的含量。bDNA 技術(shù)是目前核酸直接量化檢測技術(shù)中靈敏度最高的方法之一。但該方法成本較高，不利于其普及應(yīng)用。5、原位雜交 直接在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行雜交反應(yīng)。該技術(shù)可檢出細(xì)胞中單拷貝mRNA，估算病毒在宿主細(xì)胞中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的程度，對于病毒感染（特別是具有長潛伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的診斷很有用。6、液相雜交 液相雜交酶免疫法量化檢測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物 這種方法同固相雜交量化檢測核酸擴(kuò)增

5、產(chǎn)物原理大致相同，只是將反應(yīng)體系換為液相環(huán)境。應(yīng)用液相雜交量化檢測維生素 D 結(jié)合蛋白基因，在 PCR 擴(kuò)增時(shí)通過摻入法使產(chǎn)物上掛有地高辛分子，再通過液相雜交與標(biāo)記有生物素的探針結(jié)合后，被包被有鏈親和素的酶標(biāo)微孔板捕獲，利用辣根酶標(biāo)記的地高辛抗體使酶反應(yīng)底物(OPD 或 TMB)顯色。據(jù)報(bào)道，核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針在液相中的雜交效率要高于在酶標(biāo)微孔板上的結(jié)合，液相雜交的靈敏度通常是固相雜交的 10～20 倍，可以檢測到 pg水平。二、

6、 二、 聚合酶鏈反應(yīng)（ 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR 是近年來發(fā)展起來的一種快速的 DNA 片段擴(kuò)增技術(shù)，它通過分別與雙鏈目的 DNA 序列兩個(gè) 3’端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，由 Taq DNA 聚合酶從 5’到3’進(jìn)行一系列 DNA 聚合反應(yīng)，擴(kuò)增出所需要的目的 DNA。由于每個(gè)循環(huán)中合成的引物延伸產(chǎn)物可作為下一循環(huán)中的模板，因而每次循環(huán)中靶 DNA 的拷貝數(shù)幾乎呈幾何級(jí)數(shù)增長，因此，20 次 PCR 循環(huán)將產(chǎn)生約一百萬倍（220）的擴(kuò)