分子生物學檢測技術概述

1、1分子生物學檢測技術 分子生物學檢測技術分子生物學診斷技術是現(xiàn)代分子生物學與分子遺傳學取得巨大進步的結晶，是在人們對基因的結構以及基因的表達和調控等生命本質問題的認識日益加深的基礎上產(chǎn)生的。近年來，分子生物學診斷技術的方法學研究取得了很大進展，先后建立了限制性內切酶酶譜分析、核酸分子雜交、限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析等方法。1985 年由美國 Cetus 公司人類遺傳學研究室 Mullis 等創(chuàng)立并隨后迅速發(fā)展起來的 DNA 體外擴增

2、技術（Polymerase Chain Reaction, PCR） ，以及 90 年代發(fā)展起來的 DNA 芯片技術（DNA Chip） ，又將分子生物學診斷技術提高到一個嶄新的階段。一、 一、 核酸分子雜交 核酸分子雜交（一）概述：具有一定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按堿基互補配對原則締合成異質雙鏈的過程叫核酸分子雜交。應用該技術可對特定 DNA 或 RNA 序列進行定性或定量檢測。到目前為止，分子雜交技術在基因診斷中仍占重

3、要地位，它按反應支持物可分為固相雜交和液相雜交兩種，前者應用較廣，有 Southern印跡雜交、點雜交、夾心雜交（三明治雜交） 、原位雜交和寡核苷酸探針技術等。核酸分子雜交主要涉及兩個方面：待測的 DNA 或 RNA，以及用于檢測的DNA 或 RNA 探針。探針標記的好壞決定檢測的敏感性。1、Southern 印跡雜交 是最經(jīng)典和應用最廣泛的雜交方法。 根據(jù)基因探針與待測 DNA 限制酶酶解片段雜交的帶譜，可以直接確定宿主基因的缺陷

4、所在或病原體的存在狀態(tài)。3光檢測核酸的含量。bDNA 技術是目前核酸直接量化檢測技術中靈敏度最高的方法之一。但該方法成本較高，不利于其普及應用。5、原位雜交 直接在組織切片或細胞涂片上進行雜交反應。該技術可檢出細胞中單拷貝mRNA，估算病毒在宿主細胞中復制和轉錄的程度，對于病毒感染（特別是具有長潛伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的診斷很有用。6、液相雜交 液相雜交酶免疫法量化檢測核酸擴增產(chǎn)物 這種方法同固相雜交量化檢測核酸擴增

5、產(chǎn)物原理大致相同，只是將反應體系換為液相環(huán)境。應用液相雜交量化檢測維生素 D 結合蛋白基因，在 PCR 擴增時通過摻入法使產(chǎn)物上掛有地高辛分子，再通過液相雜交與標記有生物素的探針結合后，被包被有鏈親和素的酶標微孔板捕獲，利用辣根酶標記的地高辛抗體使酶反應底物(OPD 或 TMB)顯色。據(jù)報道，核酸擴增產(chǎn)物與特異性探針在液相中的雜交效率要高于在酶標微孔板上的結合，液相雜交的靈敏度通常是固相雜交的 10～20 倍，可以檢測到 pg水平。二、

6、 二、 聚合酶鏈反應（ 聚合酶鏈反應（PCR）PCR 是近年來發(fā)展起來的一種快速的 DNA 片段擴增技術，它通過分別與雙鏈目的 DNA 序列兩個 3’端互補的寡核苷酸引物，由 Taq DNA 聚合酶從 5’到3’進行一系列 DNA 聚合反應，擴增出所需要的目的 DNA。由于每個循環(huán)中合成的引物延伸產(chǎn)物可作為下一循環(huán)中的模板，因而每次循環(huán)中靶 DNA 的拷貝數(shù)幾乎呈幾何級數(shù)增長，因此，20 次 PCR 循環(huán)將產(chǎn)生約一百萬倍（220）的擴