基于HA的Legumain響應型緩控釋藥物載體制備及生物學效應.pdf

1、實驗目的：
　　產(chǎn)生毒副作用是腫瘤藥物治療失敗的關(guān)鍵性因素?；谀[瘤組織高表達Legumain和CD44(透明質(zhì)酸受體)的生物學特性，我們設(shè)計、制備了基于透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的Legumain響應釋放阿霉素載體，使阿霉素（Doxorubicin，DOX）在Legumain及CD44高表達的惡性腫瘤組織中聚集、釋放，提高藥物對腫瘤組織的靶向性，增加藥物的治療效果。藥物的靶向運輸和緩釋是增加藥物的治療效果和

2、減少藥物的副作用的一項重要措施，本項目的實施對于探索腫瘤藥物靶向治療新方法具有重要的理論和實踐意義。
　　實驗方法：
　　為了實現(xiàn)Legumain響應釋放的效果，首先將DOX與Legumain的底物多肽（PEP）化學鍵合，形成阿霉素-多肽衍生物（DOX-PEP）。用柱層析的方法分離純化，得到DOX-PEP純品，并用ESI-MS、NMR等對DOX-PEP進行結(jié)構(gòu)解析。隨后將DOX-PEP在EDC/NHS催化下，嫁接到HA的羧基

3、上，并用微乳化法在ADH作用下進一步交聯(lián)，形成多面體狀的HA-PEP-DOX載藥納米粒子。應用馬爾文粒度分析儀測定納米顆粒的粒徑、Zeta電位、多分散指數(shù)（PDI），并評價納米顆粒在酸性條件（pH5.0）和中性條件（pH7.0）下的穩(wěn)定性。使用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察納米粒子的形貌特征。使用UPLC-MS-MS檢測Legumain敏感的納米藥物的體外釋放情況。使用雙掃描激光共聚焦顯微鏡觀察各細胞對藥物的攝取

4、并用流式細胞術(shù)定量細胞對藥物的攝取。使用CCK-8評價藥物的細胞毒性。構(gòu)建A549人肺癌異種移植瘤模型，將透明質(zhì)酸包載藥物及游離DOX通過尾靜脈注入動物體內(nèi)，定時取血，熒光法測定血清中阿霉素總量（包括釋放和未釋放），并用UPLC-MS-MS測定釋放的藥物濃度（DOX-Leu）。以獲得該納米藥物在體內(nèi)的緩釋及Legumain響應性質(zhì)。提取正常組織和腫瘤組織的蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白測定試劑盒對提取的粗蛋白進行 Legumain酶活性評價。用

5、 Cy5.5近紅外熒光探針標記HA-PEP-DOX納米藥物，并將其及游離Cy5.5通過尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，使用小動物活體成像系統(tǒng)在不同時間點觀察近紅外熒光發(fā)射強度（激發(fā)光670 nm，發(fā)射光710 nm），觀察納米藥物的體內(nèi)分布及腫瘤靶向性。使用酶標儀測定實驗組的荷瘤小鼠各組織PBS提取液中DOX的熒光信號（激發(fā)光470 nm，發(fā)射光590 nm），以定量納米藥物及游離藥物的組織分布情況。為了研究納米藥物的體內(nèi)抗腫瘤功效，將游離DO

6、X、納米藥物及PBS經(jīng)尾靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，首次給藥后40天內(nèi)觀察小鼠的腫瘤體積及存活率。將經(jīng)一段時間藥物治療的荷瘤小鼠的腫瘤組織及心、肝、脾、腎等正常組織取出制成石蠟切片，并對腫瘤組織的切片進行H&E染色，TUNEL細胞凋亡實驗及Ki-67免疫組織化學染色，以評價腫瘤組織的組織學變化及細胞凋亡情況。對正常組織的石蠟切片進行H&E染色，TUNEL細胞凋亡實驗以評價藥物的系統(tǒng)毒性。
　　實驗結(jié)果：
　　核磁共振譜圖證明阿霉素

7、及其多肽衍生物已成功合成并成功將其接到HA上。納米粒子粒徑約為400 nm，PDI約為0.2。TEM及SEM結(jié)果表明，納米粒子粒徑約為300-500 nm，為多面體結(jié)構(gòu)。藥物穩(wěn)定性實驗表明，納米粒子在生理條件（pH7.0）下較穩(wěn)定，而在酸性條件（pH5.0）下穩(wěn)定性較差。體外釋放結(jié)果表明，藥物釋放受Legumain調(diào)控。細胞攝取實驗表明，癌細胞（A549， MCF-7和MCF-7/ADR）及正常細胞（L929）對納米粒子的攝取量均高于對

8、游離DOX的攝取量。并且，癌細胞對納米粒子的攝取比正常細胞更顯著。細胞毒性實驗表明，相同藥物濃度下，納米粒子對癌細胞的細胞毒性更顯著，對正常細胞的細胞毒性不明顯；而游離DOX對癌細胞的細胞毒性不明顯，當其作用于正常細胞（L929）時，一半以上的細胞活力被抑制。小鼠血藥濃度變化情況表明，載藥納米粒子具有很好的緩釋作用。提取的粗蛋白樣品的Legumain酶活性評價結(jié)果表明，腫瘤組織的Legumain活性顯著高于其它組織。用腫瘤組織提取的蛋白

9、與透明質(zhì)酸包載的藥物共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，藥物釋放顯著增加。小動物體內(nèi)成像結(jié)果顯示，納米藥物可在腫瘤組織中累積、釋放，具有良好的緩釋性和腫瘤靶向性。使用酶標儀測定實驗組的荷瘤小鼠各組織PBS提取液中DOX的熒光信號，結(jié)果表明注射納米藥物的荷瘤小鼠腫瘤組織中DOX的熒光值是游離DOX組的5倍，并且與游離DOX相比，HA-PEP-DOX納米藥物在心臟、肝臟和腎臟中分布很少。納米藥物體內(nèi)抗腫瘤特性研究結(jié)果顯示，對照組的腫瘤體積隨時間變化快速增加；

10、游離DOX可以抑制腫瘤生長，但對小鼠具有全身毒性，這會影響小鼠的存活率；而我們制備的納米藥物可明顯抑制腫瘤生長且毒性較低，具有很高的治療功效。荷瘤小鼠的心、肝、脾、腎及腫瘤組織切片的H&E染色，TUNEL細胞凋亡實驗和Ki-67免疫組織化學染色結(jié)果顯示，對照組的腫瘤組織生長旺盛；藥物治療組（游離DOX及納米藥物處理組）的腫瘤細胞發(fā)生凋亡，其中， HA-PEP-DOX納米藥物治療組的腫瘤組織尺寸減小，具有最高的細胞凋亡率和壞死率，并且對正