異菌脲降解菌的分離鑒定、降解特性及降解途徑研究.pdf

1、異菌脲是一種高效廣譜的二甲酰亞胺類觸殺型殺菌劑，對(duì)多種果樹、蔬菜、瓜果類作物的早期落葉病、灰霉病、早疫病等真菌病害具有良好的防治效果，但是土壤和作物中殘留的異菌脲也給食品安全及人類的健康帶來了隱患。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)因具有高效、安全、無二次污染以及生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而成為消除環(huán)境中異菌脲殘留的主要手段。目前，有關(guān)異菌脲降解菌的報(bào)道有3篇，而且它們對(duì)異菌脲的降解效率都不高，因此急需分離到高效異菌脲降解菌;與異菌脲降解相關(guān)的酶也未

2、見報(bào)道，降解途徑還沒有完全闡明。本文旨在分離高效的異菌脲降解菌，研究其對(duì)異菌脲的降解機(jī)理，為其在生物修復(fù)中應(yīng)用提供菌株資源和理論依據(jù)。
　　主要取得以下結(jié)果:
　　1)從某農(nóng)藥廠廢水處理系統(tǒng)的活性污泥中分離到一株異菌脲降解菌YJN-G，通過形態(tài)特征、生理生化鑒定和16S rRNA相似性分析，將其初步鑒定為微桿菌屬（Microbacterium sp.）。菌株YJN-G在pH值為6.0～9.0生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH為7.0;最

3、適生長(zhǎng)溫度為30℃;在不高于30 gL-1的NaCl濃度下正常生長(zhǎng)。
　　2)菌株YJN-G能夠以異菌脲為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。當(dāng)接種量為5％時(shí)，在24 h內(nèi)可以降解100mg L-1的異菌脲。菌株YJN-G降解異菌脲的最適pH是7.0，最適溫度為30～37℃;在一定的范圍內(nèi)，異菌脲降解率與接種量成正相關(guān);在2mmol L-1的條件下，Ba2+和Mn2+對(duì)異菌脲降解沒有顯著地影響，Ni2+有一定抑制作用，Cd2+抑制作用更大，而Cu2

4、+、Hg+能夠完全抑制菌株YJN-G對(duì)異菌脲的降解。
　　3)利用HPLC檢測(cè)了菌株YJN-G降解異菌脲的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)菌株在降解異菌脲的過程中會(huì)積累一個(gè)產(chǎn)物，即使延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，這個(gè)產(chǎn)物也不會(huì)減少。通過質(zhì)譜分析將其鑒定為N-（3，5-二氯苯基）-2，4-二氧代咪唑烷，據(jù)此推測(cè)菌株YJN-G可以通過水解酶的作用將異菌脲轉(zhuǎn)化為N-（3，5-二氯苯基）-2，4-二氧代咪唑烷和異丙基氨基甲酸，但是我們并沒有檢測(cè)到異丙基氨基甲酸，可能是因?yàn)樗鼪]

5、有紫外吸收，也可能是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，已經(jīng)被菌株YJN-G當(dāng)作支持生長(zhǎng)的碳源所利用。所以前文提到的菌株YJN-G能夠利用異菌脲作為唯一碳源生長(zhǎng)，其實(shí)是利用降解異菌脲的產(chǎn)物異丙基氨基甲酸作為碳源生長(zhǎng)。
　　由于異菌脲具有在堿性條件下水解的特性，因此我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究了菌株YJN-G對(duì)異菌脲的降解是不是由于堿水解的作用。結(jié)果顯示，在pH等于9的條件下，異菌脲被水解成3-甲酸-5-（3，5-二氯苯基）脲基乙酸和異丙胺，不同于菌株降解異

6、菌脲的產(chǎn)物。而且當(dāng)pH回調(diào)到7時(shí)，大部分堿水解產(chǎn)物又會(huì)重新形成異菌脲。這個(gè)結(jié)果說明，菌株YJN-G對(duì)異菌脲的降解是由于菌產(chǎn)生酶的作用。
　　4)根據(jù)菌株YJN-G降解異菌脲的途徑，我們推測(cè)將異菌脲轉(zhuǎn)化為N-（3，5-二氯苯基）-2，4-二氧代咪唑烷和異丙基氨基甲酸的酶是水解酶，命名為異菌脲水解酶。對(duì)其粗酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示它的最適作用溫度為30～37℃，最適pH為7;酶的定域?qū)嶒?yàn)表明，異菌脲水解酶主要存在于細(xì)胞內(nèi)，屬于