減毒大腸桿菌作為口服疫苗投遞載體的研究.pdf

1、腸致病性大腸桿菌(E.coli)引起的仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹瀉、脫水，并導(dǎo)致大批仔豬死亡，嚴(yán)重影響仔豬的成活率。由于E.coli耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致藥物治療的效果越來越差，因此研制有效預(yù)防仔豬大腸桿菌性腹瀉的疫苗對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生具有重要的實(shí)際意義。
　　腸致病性E.coli的流行情況復(fù)雜，其攜帶的毒力因子在不同的國(guó)家或地區(qū)的流行情況不同，即使在同一地區(qū)，毒力因子在不同年份的流行情況也有差別。本研

2、究旨在對(duì)近年腸致病性E.coli毒力基因分布進(jìn)行調(diào)查，為疫苗抗原基因的選擇提供依據(jù);根據(jù)仔豬大腸桿菌性腹瀉的感染特點(diǎn)，探索以減毒大腸桿菌作為口服疫苗投遞載體的可行性。
　　本研究從38個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集了290份糞便樣品，從中分離得到了381株E.coli。對(duì)E.coli分離株進(jìn)行了毒力因子菌毛(K88、K99、987P、F41、F18、F17)、非菌毛黏附因子(AIDA-Ⅰ、paa、CS31A、eae、saa)、腸毒素（LT-Ⅰ、

3、LT-Ⅱ、STa、STb、EAST1）、志賀毒素(Stx1、Stx2、Stx2e)、毒力島(HPI、LEE)、α-溶血素(hlyA)、afa8基因簇(afaD、afaE)及sepA基因的PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在381株E.coli中，有206株攜帶至少一個(gè)毒力基因。這些毒力基因的檢出結(jié)果分別為EAST1(n=120)、irp2(n=59)、paa(n=50)、STb(n=41)、AIDA-Ⅰ(n=34)、 LT-Ⅰ(n=23)、ler(

4、n=11)、hlyA(n=9)、K88(n=8)、eae(n=8)、STa(n=7)、sepA(n=6）、F18(n=5)、afaD(n=3)、afaE(n=3)、K99(n=2)及Stx2e(n=1)，而且，大多數(shù)菌株同時(shí)攜帶多個(gè)毒力因子。在檢測(cè)的毒力基因中，EAST1(58％)、irp2(29％)、AIDA-Ⅰ(16.5％)、paa(24％)及STb(20％)的檢出率較高，黏附因子的檢出率較低，在206株攜帶毒力基因的E.coli中

5、，超過半數(shù)的菌株不攜帶任何黏附因子。
　　仔豬大腸桿菌性腹瀉主要是以消化道為感染途經(jīng)，因此，口服疫苗免疫更接近自然感染過程。本研究用G-DOC及λRed同源重組系統(tǒng)敲除了野生E.coli O142中的STa基因，構(gòu)建了減毒E.coli O142:△STa，選擇其假基因yaiT為抗原基因插入位點(diǎn)，建立分別以Kil基因和mKate2基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的雙向篩選平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，用同源重組技術(shù)分別構(gòu)建表達(dá)嵌合類毒素LT192-STa13及L

6、T192-STb的重組大腸桿菌ER-A和ER-B，并對(duì)其腸毒性、消化環(huán)境生存能力、口服安全性、生長(zhǎng)能力、遺傳穩(wěn)定性、菌毛生長(zhǎng)能力、腸道定植能力進(jìn)行了檢測(cè)，評(píng)估了這兩株重組E.coli作為口服疫苗的免疫效果。重組菌主要生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示，重組菌ER-A及ER-B不具有腸毒性;在pH2.5和pH3.5的胃液中均能保持較高的存活率，在模擬腸液中可生長(zhǎng)，在0.05％的膽汁酸鹽環(huán)境中生長(zhǎng)良好;分別以109CFU和1010CFU的ER-A和ER

7、-B口服免疫小鼠，小鼠的日采食量和精神況與對(duì)照組小鼠無明顯差異，安全性良好;ER-A及ER-B與初始菌E.coli O142及毒素基因敲除的E.coli O142:△STa的生長(zhǎng)曲線幾乎一致，說明STa毒素基因的敲除和類毒素基因的插入對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝沒有造成影響;ER-A及ER-B在連續(xù)100次傳代后，插入的LT192-STa13和LT192-STb操縱子未見丟失，具有良好的遺傳穩(wěn)定性;ER-A及ER-B的菌體表明可正常的長(zhǎng)出菌毛，說明

8、STa毒素基因的敲除和類毒素基因的插入未影響菌毛的生長(zhǎng);ER-A及ER-B可在小鼠腸道內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活，說明其具有良好的腸道定植能力。
　　重組菌ER-A及ER-B對(duì)BALB/c小鼠口服免疫效果檢測(cè)結(jié)果顯示，ER-A免疫組（A組）、ER-B免疫組（B組）、混合免疫組（M組）小鼠在首次免疫后的7～21d，在其血清中均可檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.

9、05)的IgG抗體，首次免疫后第42d，小鼠乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體;各免疫組的小鼠在首次免疫后的7～28d，在其糞便中均可檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體，首次免疫后第42d，

10、小鼠乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體。與對(duì)照組脾細(xì)胞和腸系膜淋巴細(xì)胞增殖效果相比，A、B和M免疫組都具有更強(qiáng)的刺激增殖效果(P＜0.05)，脾細(xì)胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值與對(duì)照組相比差異不明顯，而腸系膜淋巴細(xì)胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值小于1，發(fā)生了

11、顯著的平衡漂移，與對(duì)照組相比差異明顯，說明本研究對(duì)小鼠的口服免疫沒有能夠刺激小鼠全身的Th型細(xì)胞免疫應(yīng)答，但刺激小鼠產(chǎn)生了局部黏膜的Th2類細(xì)胞免疫反應(yīng)。A、B和M組小鼠的血清、腸粘液、脾細(xì)胞裂解液、腸系膜淋巴細(xì)胞裂解液可對(duì)腸毒素產(chǎn)生明顯的中和效果。
　　重組菌ER-A及ER-B對(duì)豬口服免疫效果檢測(cè)結(jié)果顯示，ER-A及ER-B可在豬腸道內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活，有良好的腸道定植能力。ER-A免疫組（A組）、ER-B免疫組（B組）、混合免疫組（

12、M組）豬在首次免疫后的7～28d，在其血清中均可檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體，首次免疫后第42d，豬的乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgG抗體;A、B和M組豬在首次免疫后的14～28d，在其

13、糞便中均可檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體，首次免疫后第42d，小鼠乳汁、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸黏液中幾乎都能檢測(cè)到抗LTA(P＜0.05)、LTB(P＜0.05)、STa(P＜0.05)、STb(P＜0.05)、F41(P＜0.05)的IgA抗體。與對(duì)照組脾細(xì)胞、腸系膜淋巴細(xì)胞及血液淋巴細(xì)胞的增殖效果相比，A、B和M組都具有更強(qiáng)的

14、刺激增殖效果(P＜0.05)。活菌免疫組的脾細(xì)胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值與對(duì)照組相比差異不顯著，而腸系膜淋巴細(xì)胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值小于1，發(fā)生了顯著的平衡漂移，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，說明本研究對(duì)仔豬的口服免疫沒有能夠刺激仔豬全身的Th型細(xì)胞免疫應(yīng)答，但刺激仔豬產(chǎn)生了局部黏膜的Th2類細(xì)胞免疫反應(yīng)。A、B和M組仔豬的血清、腸粘液、脾細(xì)胞裂解液、腸系膜淋巴細(xì)胞裂解液可對(duì)腸毒素

15、產(chǎn)生明顯的中和效果。各免疫組的仔豬在攻毒后，其腸絨毛高度、隱窩深度、腸絨毛高度/隱窩深度比值與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.05)。
　　本研究通過對(duì)豬源腸致病性E.coli毒力基因的調(diào)查，明確了當(dāng)前主要流行的菌株主要攜帶EAST1、irp2、AIDA-Ⅰ、paa和STb等毒力基因，很少攜帶黏附因子基因，為疫苗抗原基因的選擇提供了依據(jù);重組菌ER-A和ER-B對(duì)小鼠和豬的免疫效果檢測(cè)證明，口服疫苗可以誘導(dǎo)小鼠和豬良好的體液免疫和細(xì)