擬南芥AtPSL4參與ABA信號(hào)通路的機(jī)理研究.pdf

1、植物激素脫落酸（abscisic acid，ABA）作為植物體內(nèi)最重要的植物激素之一，參與調(diào)控了植物多種生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程，如種子成熟、種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、氣孔運(yùn)動(dòng)以及開(kāi)花等。此外，ABA在植物響應(yīng)外界各種環(huán)境脅迫的過(guò)程中也扮演著非常重要的角色，被稱(chēng)為逆境激素。
　　目前最為認(rèn)可的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路含有三種核心組分：ABA受體PYR/PYL/RCAR蛋白、負(fù)調(diào)控因子2C類(lèi)蛋白磷酸酶（PP2C）和正調(diào)控因子 SNF1相關(guān)蛋白激酶2（Sn

2、RK2），它們組成一個(gè)雙重負(fù)調(diào)控系統(tǒng)來(lái)控制ABA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)以擬南芥為研究材料，通過(guò)用NaCl、甘露醇、ABA等處理超表達(dá)株系、突變體和野生型幼苗來(lái)研究AtPSL4的功能。研究結(jié)果和主要結(jié)論如下：
　?。?）通過(guò)對(duì)GENEVESTIGATOR和Arabidopsis eFP Browser數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前iTRAQ數(shù)據(jù)的結(jié)果，鑒定出潛在的響應(yīng)鹽脅迫的候選基因，并最終選擇了AtPSL4作為研究對(duì)象開(kāi)展下一步實(shí)驗(yàn)。

3、AtPSL4基因編碼一個(gè)類(lèi)葡萄糖苷酶IIβ亞基，其CDS全長(zhǎng)包括1944個(gè)堿基，編碼一條647個(gè)氨基酸的多肽鏈。通過(guò)與擬南芥及其他物種比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)AtPSL4進(jìn)化非常保守，且無(wú)旁系同源基因，其N(xiāo)端存在信號(hào)肽和PRKCSH-like結(jié)構(gòu)域，C端存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)和PRKCSH_1結(jié)構(gòu)域。
　?。?）通過(guò)萌發(fā)時(shí)野生型和AtPSL4超表達(dá)對(duì)鹽、甘露醇的響應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)AtPSL4超表達(dá)株系的萌發(fā)速率明顯高于野生型；萌發(fā)后，AtPSL4超

4、表達(dá)株系的幼苗子葉變綠的速度也快于野生型。說(shuō)明AtPSL4正調(diào)控萌發(fā)和萌發(fā)后幼苗的生長(zhǎng)。
　?。?）通過(guò)高通量數(shù)據(jù)和qRT-PCR的方法對(duì)AtPSL4的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AtPSL4存在一定的組織表達(dá)特異性，其中在根中的表達(dá)量最多，在花中幾乎不表達(dá)；另外， AtPSL4受ABA誘導(dǎo)明顯上調(diào)，而受鹽、甘露醇等的影響較小。
　?。?）通過(guò)構(gòu)建PSL4與GFP的融合蛋白載體，進(jìn)行煙草瞬時(shí)侵染，發(fā)現(xiàn)PSL4定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。片段缺失

5、實(shí)驗(yàn)表明N端信號(hào)信號(hào)肽在其定位中發(fā)揮重要功能。
　?。?）利用多效唑作為赤霉素合成的抑制劑，發(fā)現(xiàn)AtPSL4超表達(dá)株系萌發(fā)速度依舊高于野生型。同時(shí)，用qRT-PCR檢測(cè)了赤霉素合成代謝及響應(yīng)的marker基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)AtPSL4超表達(dá)株系和野生型沒(méi)有明顯差別，表明AtPSL4未參與到赤霉素信號(hào)通路中，暗示它可能參與了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。
　　（6）當(dāng)存在ABA時(shí)，AtPSL4超表達(dá)株系的萌發(fā)速度高于野生型，且隨著ABA

6、濃度的升高，差異越來(lái)越明顯。利用qRT-PCR檢測(cè)了ABA信號(hào)通路marker基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)ABI3、ABI4、ABI5、RD29A等在AtPSL4超表達(dá)中表達(dá)量明顯下降，而PYL/PYRs、PP2Cs、SnRKs的表達(dá)量未表現(xiàn)差異，說(shuō)明AtPSL4參與了ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，且可能在SnRKs下游、ABI5上游發(fā)揮功能。
　?。?）利用酵母雙雜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 PSL4與CaM2.1、CaM4.1、CaM6、CaM7的互作情況，發(fā)現(xiàn)