FA信號通路參與大腸癌分子發(fā)病機制的實驗研究.pdf

1、大腸癌臨床常見,全球每年有102萬新發(fā)病例和53萬死亡病例。在消化道腫瘤中發(fā)病率已僅次于胃癌,位居第二。大腸癌病因未明,近年的研究表明家族性乳腺癌相關(guān)基因BRCA1基因突變與大腸癌的相關(guān)危險度為1.4,BRCA2基因突變與大腸癌的相關(guān)危險度為4.4,大腸癌的發(fā)生似與FA/BRCA通路的異常相關(guān)。
　　 范可尼貧血(Faneoni Anemia,FA)是一種具有腫瘤傾向的,少見的遺傳性疾病,由調(diào)節(jié)DNA損傷的FA(或稱FA-BRC

2、A)通路蛋白的系列基因突變引起。FA-BRCA通路蛋白功能的錯誤表達導致DNA損傷修復的缺陷,特別是DNA交聯(lián)的異常,最終導致染色體不穩(wěn)定。FA-BRCA通路中的關(guān)鍵蛋白FANCD2的活化調(diào)控著FA-BRCA通路,95％的FA病人存在FANCD2功能異常。FA病人異常增高的腫瘤傾向證明了FANCD2的腫瘤抑制作用。目前FANCD2的功能未明,本研究旨在闡述FANCD2的復制后修復功能,了解其與HHR6和FA-BRCA通路問的關(guān)系,為研究

3、FANCD2在大腸癌發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。
　　 FA-BRCA通路作為腫瘤病因?qū)W的遺傳模型日益受到重視。而FA-BRCA通路在人類非-FA腫瘤發(fā)生中的作用所知甚少。我們通過前期研究推測FA-BRCA通路的異常是由FA復合體蛋白之一FANCL的變異體FAVL觸發(fā),在我們檢測的腫瘤細胞系中,半數(shù)以上的腫瘤細胞系FAVL表達明顯增高,這很可能隱藏著人類腫瘤發(fā)生的重要的因為。我們是第一批探討FA-BRCA腫瘤抑制通路,在人類非-F

4、A腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用的研究者。
　　 細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,目前發(fā)現(xiàn)有10種家族成員,有不同程度的同源性。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase8,CDK8)定位于13q12,13,是CDK家族的一個成員,對細胞分裂周期的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用,為細胞周期的正性調(diào)節(jié)因子。CDK8是其自身誘導的細胞轉(zhuǎn)化及β-catenin調(diào)節(jié)基因表達所必須的,是一個真正的癌

5、基因。BRCA1可以通過CDK抑制因子p21waft使細胞周期停滯于S期,通過調(diào)控有絲分裂中紡錘體組裝,參與G2/M期檢測點的調(diào)節(jié),當DNA損失時,BRCA1作為一種負性調(diào)控因子參與細胞周期檢測點的調(diào)節(jié)。BRCA1有多個磷酸化位點,其作用各不相同。G1/S期,BRCA1以鋅指結(jié)構(gòu)域作為主要作用域,通過轉(zhuǎn)錄因子E2F的作用和細胞周期蛋白CDKS作用物的磷酸化,抑制細胞進入增殖周期,阻止細胞分裂,誘發(fā)細胞凋亡。本研究中采用實時定量RT-PC

6、R檢測CDK8在大腸癌組織中的表達,并結(jié)合臨床資料,探討其與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,為進一步研究CDK8與FA-BRCA腫瘤抑制通路關(guān)系及其在大腸癌分子發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。
　　 本研究分三部分:
　　 第一部分:FANCD2單泛素化是HHR6和FA-BRCA通路間的連接方式
　　 第二部分:FA蛋白L的變異體FAVL促進人類非范可尼腫瘤的發(fā)生
　　 第三部分:CDK8在大腸癌中的表達及其意義

7、　　 第一部分:FANCD2單泛素化是HHR6和FA-BRCA通路間的連接方式
　　 目的:
　　 探討FANCD2單泛素化與HHR6和FA-BRCA通路間的關(guān)系
　　 方法:
　　 采用MCF-7等細胞系用RNAi的方法下調(diào)HHR6,UBE2T和FANCL,用免疫印跡分析FANCD2單泛素化的變化情況；用細胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)HHR6,用免疫印跡分析FANCD2單泛素化的變化情況。用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glu

8、-tathiones—transferase,GST)標記FANCL催化亞基,行GST-pulldown試驗和蛋白質(zhì)印跡,用抗UBE2T、HHR6或GST的抗體對其進行分析。采用RNAi的方法下調(diào)HHR6、UBE2T和FANCL,經(jīng)過MMC處理,觀察各組細胞存活率的變化。采用RNAi的方法下調(diào)HHR6,用免疫熒光、染色體核型分析等技術(shù)和共聚焦顯微鏡等設(shè)備,觀察HHR6水平的減低對FANCD2聚集區(qū)的影響和DNA受損時染色體異常機率的變化

9、情況。
　　 結(jié)果:
　　 結(jié)果顯示調(diào)HHR6削弱FANCD2單泛素化,HHR6的兩個亞型——HHR6A和HHR6B以類似的方式調(diào)節(jié)FANCD2單泛素化,HHR6過表達促進FANCD2單泛素化,HHR6與UBE2T以不同的方式調(diào)控FANCD2的單泛素化,HHR6通路和FA-BRCA通路對DNA交聯(lián)劑MMC的反應相同,HHR6表達減低的細胞表現(xiàn)出FANCD2聚集區(qū)的減小和染色體異常的增加。
　　 結(jié)論:
　　

10、 FANCD2單泛素化是HHR6和FA-BRCA通路間的連接方式。
　　 第二部分:FA蛋白L的變異體FAVL促進人類非范可尼腫瘤的發(fā)生
　　 目的:
　　 探討FANCL的異常連接體FAVL在人類非范可尼腫瘤發(fā)生中的作用
　　 方法:
　　 制備FAVL抗體；采用RNAi方法敲除FAVL,用抗FANCD2、FAVL和β-肌動蛋白的抗體對其進行蛋白質(zhì)印跡分析；通過細胞質(zhì)和細胞核FAVL的分析,確

11、定FAVL的定位；用FAVL抗體對腫瘤組織病理切片進行免疫組化檢測,了解不同腫瘤組織中FAVL的表達情況；用含有FAVL cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,并對細胞進行新霉素篩選兩周,MMC處理后進行蛋白質(zhì)印跡分析單泛素化FANCD2、FAVL和β-肌動蛋白的蛋白水平；用過表達FAVL的U20S細胞注射至裸鼠皮下,觀察不同F(xiàn)AVL水平的U20S細胞對異體移植腫瘤的形成的影響；用過表達FAVL的細胞進行MMC處理后,觀察細胞的存活率。
　　

12、 結(jié)果:
　　 FAVL是人類ESTBQ574618,FAVL在接近半數(shù)的己檢測腫瘤細胞系和腫瘤組織標本中高表達。內(nèi)源性和外源性的FAVL高表達都能損害FA-BRCA通路FA-BRCA通路的FAVL損傷是由減低的FANCL蛋白水平介導的,后者部分是由FAVL對FANCL在蛋白質(zhì)水平上的調(diào)控引起的。FAVL可以收集胞質(zhì)中的FANCL并促進FANCL的降解。高表達的FAVL導致FA復合物生成不足,后者對FA-BRCA通路的激活是至關(guān)

13、重要的。FAVL增強滅活FA-BRCA通路,增加了染色體不穩(wěn)定性,提供了一個重要的生長優(yōu)勢。在體內(nèi),由增強的FAVL觸發(fā)的生長優(yōu)勢促進異種移植腫瘤的生長。
　　 結(jié)論:
　　 FA蛋白L的變異體FAVL促進人類非范可尼腫瘤的發(fā)生。
　　 第三部分:CDK8在大腸癌中的表達及其意義
　　 目的:
　　 1.探討細胞周期蛋白依賴性激酶8(CDK8)在大腸癌中的表達情況。
　　 2.探討CDK8

14、表達情況與大腸癌患者臨床病理資料的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1.采用SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR技術(shù)對50例大腸癌組織和相應正常大腸黏膜組織中的CDK8 mRNA的表達進行檢測。
　　 2.分析CDK8表達情況與大腸癌患者臨床病理資料的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1.大腸癌組織中大腸癌組織中CDK8 mRNA的相對表達水平[1.1055(0.6262,1.7770)]顯著高于相

15、應的正常組織[0.5545(0.2910,1.0022)](P<0.05)。
　　 2.有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中CDK8mRNA的相對表達水平[1.1695(0.8740,2.7317)]顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織[0.8535(0.3542,1.7072)](P<0.05)。按腫瘤TNM分期對大腸癌組織進行分組,T3/T4期癌組織CDK8mRNA的表達水平[1.5915(0.9965,2.2892)]顯著高于T1/T2