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文檔簡(jiǎn)介
1、大腸癌正成為人類發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,而從分子生物學(xué)層面探討大腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。BMP7-Ids信號(hào)通路在惡性腫瘤中的作用近年來(lái)正逐步得到關(guān)注,但很多問(wèn)題未得到闡明。
本實(shí)驗(yàn)以BMP7因子作為研究中心,首先檢測(cè)在臨床大腸癌組織標(biāo)本中BMP7、它的Ⅰ型受體ALK2、它的下游分子Id2和Id3的mRNA和蛋白的表達(dá),探討其與臨床因素的相關(guān)性,它們之間的關(guān)系;隨后通過(guò)在大腸癌細(xì)胞株中添加不同濃度的BMP
2、7因子,觀察細(xì)胞侵襲性和增殖性的變化,相關(guān)周期蛋白表達(dá)的變化;最后,通過(guò)基因干擾,將BMP7基因下游的兩個(gè)因子Id2和Id3沉默,探討在BMP7因子促進(jìn)侵襲性和增殖性的過(guò)程中,Id2和Id3所起的作用。
第一部分BMP7-Ids信號(hào)通路相關(guān)分子在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義
目的:
探討臨床大腸癌組織標(biāo)本中BMP7、它的Ⅰ型受體ALK2、它的下游基因Id2和Id3的mRNA和蛋白的表達(dá),與臨床因素的
3、關(guān)系,它們相互之間的關(guān)系;并檢測(cè)相關(guān)大腸癌細(xì)胞株BMP7蛋白的表達(dá)。
方法:
臨床收集60例大腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本,并去病理科收集這些病人的石蠟切片標(biāo)本。采用Real-Time PCR和免疫組化方法分別檢測(cè)這些標(biāo)本中BMP7、ALK2、Id2和Id3基因的mRNA和蛋白表達(dá),分析它們的臨床意義;采用ELISA方法檢測(cè)大腸癌細(xì)胞株SW480、HCT116和HT29的BMP7蛋白的表達(dá)。
結(jié)果
4、:
大腸癌組織中BMP7的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于正常組織,BMP7的mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移以及Duke分期明顯相關(guān),BMP7的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)明顯相關(guān);大腸癌組織中ALK2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于正常組織,ALK2的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)明顯相關(guān);大腸癌組織中的Id2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于正常組織,Id2的mRNA表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和是否有肝轉(zhuǎn)移明顯相關(guān),Id2的蛋白表達(dá)與
5、mRNA表達(dá)明顯相關(guān);大腸癌組織中Id3的mRNA和蛋白表達(dá)與正常組織相比無(wú)明顯差異;大腸癌組織中Id2的mRNA表達(dá)與BMP7的mRNA表達(dá)明顯相關(guān)。在大腸癌細(xì)胞株中,HT29細(xì)胞幾乎不表達(dá)BMP7因子,SW480細(xì)胞的BMP7因子表達(dá)量很微弱。
結(jié)論:
BMP7 mRNA在大腸癌組織中明顯表達(dá),且與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移以及Duke分期明顯相關(guān);Id2 mRNA在大腸癌組織中明顯表達(dá),且與腫瘤浸潤(rùn)深
6、度和肝轉(zhuǎn)移明顯相關(guān),這兩個(gè)因子的mRNA表達(dá)明顯相關(guān)。BMP7、ALK2和Id2的蛋白表達(dá)在腫瘤中明顯升高,并且均與mRNA表達(dá)明顯相關(guān)。Id3在腫瘤中的mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)增高。
第二部分BMP7因子對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖性及侵襲性的影響
目的:
探討B(tài)MP7因子對(duì)大腸癌細(xì)胞株侵襲性和增殖性的影響,對(duì)相關(guān)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶及其抑制劑表達(dá)的影響,以及對(duì)其下游Id2和Id3因子表達(dá)的影響。
7、 方法:
通過(guò)在大腸癌細(xì)胞株HT29中添加不同濃度的BMP7因子,并和對(duì)照組比較,用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞檢測(cè)和Western Blot實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲性和增殖性的變化,檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶及其抑制劑的表達(dá)變化以及下游的Id2和Id3因子表達(dá)的變化。
結(jié)果:
BMP7因子可以以濃度依賴性的方式增加大腸癌細(xì)胞株侵襲性和增殖性,并誘導(dǎo)細(xì)胞周期素Cyclin D1和周期依賴
8、性蛋白激酶CDK4蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑P21蛋白的表達(dá);此外,BMP7因子還可誘導(dǎo)其下游Id2和Id3因子的表達(dá),并以Id2因子的誘導(dǎo)更為顯著。
結(jié)論:
BMP7可增加大腸癌細(xì)胞的侵襲性和增殖性,而這一作用可能與細(xì)胞周期素Cyclin D1和周期依賴性蛋白激酶CDK4蛋白的表達(dá)的增加和細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子P21蛋白的表達(dá)的減弱有關(guān);BMP7因子還可誘導(dǎo)其下游Id2和Id3因子的表達(dá),并
9、以Id2因子的誘導(dǎo)更為顯著。
第三部分Ids因子在BMP7-Ids信號(hào)通路中的作用
目的:
探討Id2和Id3基因在BMP7因子促進(jìn)大腸癌細(xì)胞侵襲和增殖過(guò)程中所起的作用。
方法:
采用siRNA對(duì)大腸癌細(xì)胞株HT29的Id2和Id3基因進(jìn)行干擾,用WesternBlot方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。隨后分別與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比較,用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞檢測(cè)和Wes
10、tern Blot實(shí)驗(yàn)觀察各組大腸癌細(xì)胞株侵襲性和增殖性的變化,以及相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控因子和負(fù)性調(diào)控因子表達(dá)的變化。
結(jié)果:
經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,通過(guò)Western Blot驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Id2和Id3蛋白表達(dá)明顯下降,說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。大腸癌細(xì)胞經(jīng)Id2沉默后,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,細(xì)胞侵襲性和增殖性明顯下降,Cyclin D1表達(dá)明顯下降,P21表達(dá)明顯上升;而經(jīng)Id3沉默后,雖然也觀察到上述類似的變化,但變化幅度均不如Id
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