遺傳性非息肉病性大腸癌（HNPCC）家系研究.pdf

1、目的: 遺傳性非息肉病性大腸癌(herediarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是一常染色體顯性遺傳性疾病。約占大腸癌(colorectumcancer，CRC)總數(shù)的5％～15％。1913年Warthin首次描述遺傳性非息肉病性大腸癌病例。但直到半個(gè)世紀(jì)后1966年Lynch等才更詳細(xì)地描述了這些家系的遺傳和臨床病理特征，又稱Lynch綜合征。 MMR基因種系突變是發(fā)病的分子遺傳

2、學(xué)基礎(chǔ)，該基因的突變可導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)蛋白的截短或表達(dá)低下，復(fù)制時(shí)錯(cuò)誤增加，微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)而使腫瘤發(fā)生。HNPCC家系的發(fā)生與hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、hMSH3以及hMSH6這六個(gè)人類MMR基因突變有關(guān)。其中hMSH2與hMLH1突變?cè)贖NPCC中起主要作用，占MMR基因突變90％以上，而hPMS1和hPMS2基因突變分別與6％的HNPCC腫瘤相關(guān)。因此檢測(cè)hMSH2與hMLH1突變與高風(fēng)險(xiǎn)家系疾病表型的關(guān)系

3、非常有價(jià)值。 Vasen等研究報(bào)告：錯(cuò)配修復(fù)基因突變hMSH2與hMLH1攜帶者一生發(fā)生CRC及HNPCC相關(guān)癌的概率相同均為80％，因此找出家系中的無癥狀的基因突變攜帶者，估計(jì)這些高危人群發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，制定監(jiān)測(cè)方案，使HNPCC腫瘤的預(yù)防和早期診斷成為可能。大腸是多發(fā)癌發(fā)生最多的部位多發(fā)癌多見，經(jīng)驗(yàn)表明接受隨診的患者比未接受隨診患者的大腸癌發(fā)生率降低65％。 環(huán)境因素對(duì)遺傳是有影響的，地域不同外顯率不同，腸外腫瘤發(fā)生

4、的部位的比率不同，基因突變譜不同，歐美研究報(bào)道，hMSH2突變檢出率高于hMLH1，而亞洲人hMLH1突變多見，近幾年來，國外的報(bào)道越來越多，而我國本民族家系詳細(xì)的系統(tǒng)的特別是大樣本的報(bào)道很少。因此，檢測(cè)中國人的MMR基因突變并研究其特殊的規(guī)律對(duì)預(yù)防和處理中國人的HNPCC有重要意義。 研究目的 探討中國人主要是我國東北地區(qū)HNPCC臨床特征及分子機(jī)理，分析HNPCC患者錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)hMSH2、hMLH1遺傳性

5、突變率與大腸癌發(fā)生的關(guān)系，對(duì)于已發(fā)現(xiàn)存在遺傳性錯(cuò)配修復(fù)基因的患者，檢測(cè)其家族中的其他成員(特別是尚未出現(xiàn)腫瘤的年輕成員)，確認(rèn)突變基因攜帶者，對(duì)癌癥易感個(gè)體重點(diǎn)進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)和臨床癥狀出現(xiàn)前的早期診斷，為今后的遺傳咨詢和基因治療提供依據(jù)。 方法: 1.詳細(xì)詢問家族史，以先證者為核心繪出HNPCC家系圖，并用系譜分析方法確認(rèn)每個(gè)家系的遺傳方式。 2.獲得患者的詳盡臨床及病理學(xué)資料包括：①確診惡性腫瘤時(shí)的年齡、性別；②

6、腫瘤發(fā)生的部位(包括腸外癌)；③同時(shí)多原發(fā)結(jié)腸癌；④異時(shí)多原發(fā)結(jié)腸癌；細(xì)胞分化程度等。 3.采集組織標(biāo)本，抽取患者及直系健康的外周血抗凝-80℃保存?zhèn)溆?，以行基因檢測(cè)。 4.DNA提?。猴柡吐然c方法。 5.引物的設(shè)計(jì)與合成：從GeneBank下載MLH1及MSH2基因的35個(gè)外顯子的序列，用DNAstar軟件設(shè)計(jì)其PCR引物并進(jìn)行合成。 6.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR擴(kuò)增)：應(yīng)用LATaq酶分別對(duì)MLH1及M

7、SH2基因的35個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 7.SSCP檢測(cè)：PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯凝膠電泳，用銀染試劑盒進(jìn)行銀染色，篩查突變。(由于時(shí)間關(guān)系本實(shí)驗(yàn)略) 8.序列測(cè)定：對(duì)于PCR產(chǎn)物，經(jīng)TakaraDNAFragmentPurificationKitVer2.0純化后進(jìn)行測(cè)序。 結(jié)果: 1.33個(gè)符合Amsterdam診斷標(biāo)準(zhǔn)HNPCC家系中，確診HNPCC的患者187例，原發(fā)癌

8、灶共計(jì)219個(gè)(含異時(shí)多原發(fā)癌灶和同時(shí)多原發(fā)癌灶)。33個(gè)家系腫瘤的發(fā)病規(guī)律均為常染色體顯性遺傳。 2.187例HNPCC患者，男性103例，女性84例，平均發(fā)病年齡50歲。第一代患者的平均年齡61歲，第二代患者平均年齡為56歲，第三代患者平均年齡為41歲，第四代有5人發(fā)病，平均年齡25歲，表現(xiàn)為發(fā)病年齡逐代提前的趨勢(shì)。 3.187例者中共發(fā)生原發(fā)癌灶219個(gè)，大腸癌灶134個(gè)，占總癌灶的61％腸外癌灶85個(gè)占總癌灶的3

9、9％，其中肺癌占腸外癌灶20％，胃癌占15％，子宮內(nèi)膜癌占14％。 4.187例患者中，大腸癌患者109例，占HNPCC患者的58％。大腸多發(fā)癌23例，占大腸癌的21％。異時(shí)性病灶(都不是早期癌)最短發(fā)生時(shí)間2年，最長發(fā)生時(shí)間16年，平均7年發(fā)生第二個(gè)病灶。重復(fù)癌5例。 5.該研究首先進(jìn)行16個(gè)先證者M(jìn)SH2基因PCR產(chǎn)物測(cè)序，MLH1基因PCR產(chǎn)物測(cè)序工作正在進(jìn)行中。 6.MSH2突變率為25％；突變類型主要為

10、移碼突變，其次為錯(cuò)義突變；突變分布在MSH2基因的7、11、13、15外顯子。 討論HNPCC診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床上HNPCC的診斷主要靠家族史和臨床特征，進(jìn)一步的驗(yàn)證診斷是錯(cuò)配修復(fù)基因的檢測(cè)。該文家系選擇嚴(yán)格遵守Amster-dam標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樵摌?biāo)準(zhǔn)相當(dāng)嚴(yán)格，小的家系很難符合這一標(biāo)準(zhǔn)而無法診斷，文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)，HNPCC約占結(jié)直腸癌的1％～6％。 HNPCC腫瘤的特點(diǎn)：1.惡性腫瘤發(fā)生早：此組HNPCC確診

11、平均年齡50歲，Lynch報(bào)道遺傳性非息肉病性大腸癌平均發(fā)病年齡為45歲左右，而散發(fā)性腸癌平均發(fā)病年齡大約63歲。此組第一代患者的平均年齡61歲，第二代患者平均年齡為56歲，第三代患者平均年齡為41歲歲，第四代有5人發(fā)病，平均年齡25歲，表現(xiàn)為發(fā)病年齡逐代提前的趨勢(shì)，沒隔一代，其惡性腫瘤發(fā)生年齡約提前10歲。2.大腸癌最為常見：這是此病的最大特點(diǎn)，本組187例患者中大腸癌患者數(shù)109例，占HNPCC患者的58％。原發(fā)癌灶219個(gè)，大腸癌

12、灶134個(gè)，占總癌灶的61％。3.多原發(fā)性大腸癌多見：此組多原發(fā)性大腸癌患者占大腸癌總數(shù)的21％，有4例病人行4次手術(shù)每2年一次，呈現(xiàn)小腺瘤2-3年發(fā)生癌變，癌發(fā)生速度很快的特點(diǎn)，而一般這個(gè)過程需要8-10年，這是提出腸鏡復(fù)查每年至少一次的根據(jù)。醫(yī)生在制訂診斷、治療、隨訪計(jì)劃時(shí)，應(yīng)充分考慮這個(gè)因素，并且必須讓患者及家屬知道隨訪的重要意義。4.腸外癌灶較多、惡性腫瘤譜廣：本組腸外癌灶85個(gè)占總癌灶的39％，但值得注意的是本組腸外腫瘤中肺癌

13、發(fā)生率最高，其次是胃癌、子宮內(nèi)膜癌，與其他報(bào)告不同。西方國家腸外癌中最多見子宮內(nèi)膜癌其次卵巢癌、胃癌，日本和韓國報(bào)告胃癌最多見。未見到肺癌最多見的報(bào)告非常值得進(jìn)一步研究，也許是中國北方HNPCC的腸外癌的特點(diǎn)。關(guān)于東、西方HNPCC表型在腸外癌種類方面的差異是否與種族、生活習(xí)慣、生存環(huán)境等不同有關(guān)，環(huán)境因素對(duì)遺傳是有影響的，地域不同外顯率不同，腸外腫瘤發(fā)生的部位的比率不同，有待進(jìn)一步研究。 hMSH2突變檢測(cè)提示：1、突變率：文

14、獻(xiàn)報(bào)道HNPCC家族中最易檢測(cè)的突變?yōu)閔MSH2和hMLH1的種系突變，其突變檢出率為40％～86％，其中hM-SH2占27％～54％，本研究的突變率為25％。 hMLH1及hMSH2突變?cè)诓煌拿褡搴偷貐^(qū)，其陽性率不同，歐美hM-SH2突變的檢出率高于hMLH1，而亞洲人hMLH1突變多見。但在中國人的基因的突變中，hMSH2基因的突變占50％，與韓國人、日本人等亞洲的研究小組報(bào)道不同，可能中國人在錯(cuò)配修復(fù)基因的突變方面有異于

15、其他亞洲人的特殊規(guī)律。因此，檢測(cè)中國人的基因的突變并研究其特殊的規(guī)律對(duì)預(yù)防和處理中國人的有重要意義。 hMLH1及hMSH2突變的攜帶者，發(fā)生結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)可達(dá)80％，其他腸外癌癥的發(fā)生率亦明顯增加，因此檢測(cè)hMLH1及hMSH2基因突變的攜帶者并對(duì)其進(jìn)行定期復(fù)查對(duì)早期發(fā)現(xiàn)并處理結(jié)直腸癌，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生有重要的價(jià)值。。對(duì)HNPCC患者定期進(jìn)行腹部超聲、胃鏡、刮宮、宮頸涂片、經(jīng)陰道超聲檢查和血CEA及CA125檢測(cè)有利于早期發(fā)