中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系收集、整理及分子遺傳學和臨床病理特征分析.pdf

1、大腸癌中約25％有遺傳背景。其中家族性腺瘤性息肉病(FAP)占1％，遺傳性非息肉性大腸癌占5％～10％。其余則為散發(fā)性、炎性腸病(潰瘍性結腸炎和克隆病)等。遺傳性非息肉病性結直腸癌是一種常染色體顯性遺傳病，錯配修復基因失活所致細胞錯配修復功能的喪失或缺陷，引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的發(fā)生，是遺傳性非息肉病性結直腸癌的主要發(fā)病機制。 目前已克隆出的錯配修復基因，包括：hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPSM1、hPSM2、hMSH3、

2、hMSH5、hMLH3和EXO1等。其中hMSH2與hMLH1的突變在遺傳性非息肉病性結直腸癌中起主要作用，兩者的突變占所有錯配修復基因突變檢出的80％～90％以上，因此，hMSH2與hMLH1基因的突變是目前研究熱點。 如何應用一種有效的篩查檢測基因突變方法仍在探索中。隨著遺傳性非息肉病性結直腸癌家系遺傳學方面的研究，針對現有個體的研究已不能滿足有關遺傳學方面的深入研究。長期研究需要將家系成員的遺傳物質保留和存儲，以便在今后相

3、當長時間使研究能夠繼續(xù)下去。因此，提出建立遺傳性非息肉病性結直腸癌家系永生化細胞株的概念。應用新型免疫抑制劑環(huán)孢素A來建立EB病毒轉化的外周血淋巴母細胞，是方法學上的一大突破。 從分子遺傳表型和臨床表型來看，東西方國家由于存在地域、民族等差異，表現出遺傳性非息肉病性結直腸癌在分子遺傳表型和臨床表型不同，目前，遺傳性非息肉病性結直腸癌的診斷在國際上普遍采用Amsterdam診斷標準，但是由于該標準在臨床使用過程中暴露出一些不足，各

4、國紛紛提出了一些新的標準，如韓國人提出的可疑遺傳性非息肉病性結直腸診斷標準、瑞典人提出瑞典人遺傳性非息肉病性結直腸癌診斷標準等。結合我國實際國情，全國遺傳性大腸癌協(xié)作組針對中國人腫瘤發(fā)病特點提出了中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌診斷標準，以便能正確了解中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌的分子遺傳學和臨床特征。本研究收集、整理符合中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌標準的31個家系，針對收集整理的31個中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系臨床病理特點予

5、以分析，評價中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌診斷標準的臨床應用價值。分析中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系錯配修復基因hMLH1、hMSH2遺傳突變的特點，同時建立家系永生化細胞株。 第一部分中國人遺傳性非息肉病性結直癌家系臨床病理特征分析 目的：分析評價中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系的臨床病理特點。 方法：收集整理符合中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌診斷標準家系31個家系，記錄的數據包括患者性別、結直腸癌發(fā)生的

6、部位、診斷年齡、是否有多原發(fā)性結直腸癌及結腸外腫瘤特點、臨床分期、大體類型、組織分化程度、癌細胞黏液成分、有無腫瘤壞死等。按照Amsterdam診斷標準(含標準Ⅰ、Ⅱ)、日本標準、可疑HNPCC標準、Bethesda指導綱要、中國人HNPCC標準分為AC組、JC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組，另收集同期散發(fā)性結直腸癌35例作為對照，不同標準間進行臨床病理特點比較。 結果：31個家系共發(fā)生136例次惡性腫瘤(多原發(fā)腫瘤

7、14例)，其中結直腸癌患者106例次，占所有腫瘤患者的77.9％，診斷年齡均數48.6±29.0歲；胃癌14例，占所有腫瘤患者的10.3％；左半結腸癌和直腸癌占所有結腸癌的52.8％(56/106)；107個腫瘤患者中男性69個，女性38個，男女比例1.6：1，先證者診斷年齡均數44.8±9.7歲。符合AC者(含ACⅠ和ACⅡ)13個，符合JC者19個，符合sHNPCC者18個，符合BG者31個，患第一癌平均年齡5組不同標準的患者分別與

8、SCRC組相比較差異有顯著性(P＜0.01)。第一癌發(fā)病年齡小于50歲患者的比例前5組明顯高于SCRC組(P＜0.05)，前5組間比較差異無顯著性。 Duke's分期中，AC組、JC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組屬于A/B期例數明顯多于SCRC組，前5組A/B期例數和C/D期例數與SCRC組比較差異有顯著性(P＜0.05)。Crohn's病樣淋巴反應顯著者AC組、BG組、CHNPCC組明顯高于SCRC組(P＜0.01

9、)。AC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組外生性生長的比例高于SCRC組，AC組、BG組、CHNPCC組外生性生長和非外生性生長比例與SCRC組比較有差異顯著性P＜0.01)，sHNPCC組與SCRC組比較有差異顯著性P＜0.05)。腫瘤分化程度高中分化與低分化相比較，AC組、sHNPCC組、BG組、CHNPCC組與SCRC組有差異顯著性(P＜0.01)。腸外相關性惡性腫瘤共30例，占所有腫瘤患者的22.1％(30/136)，男

10、女性別比1.8：1，其中胃癌14例，占腸外相關性惡性腫瘤的46.3％(14/30)，多原發(fā)結直腸癌9例，結直腸癌并發(fā)腸外惡性腫瘤5例(其中胃癌4例，卵巢癌1例)。各組腸外腫瘤胃癌是第一位。 結論：(1)中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系成員結直腸癌發(fā)病年齡早于散發(fā)性大腸癌近20年。先證者發(fā)病時年齡與與西方國家報道相近。(2)中國人HNPCC家系臨床特點表現與西方國家比較不同是左半結腸癌和直腸癌多見、多原發(fā)結直腸癌比率較低、腸外惡

11、性腫瘤以胃癌最常見等。(3)中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系結直腸癌預后好于散發(fā)性大腸癌。 第二部分變性高效液相色譜儀檢測中國人遺傳性非息肉病性結直腸家系錯配修復基因hMSH2、hMLH1突變 目的：建立并評價用變性高效液相色譜儀檢測錯配修復基因hMLH1、hMSH2基因突變的方法；分析符合中國人遺傳性非息肉性結直腸癌診斷標準家系hMLH1、hMSH2基因遺傳性突變特點。結合不同診斷標準，分析評價中國人遺傳性非息肉性結

12、直腸癌診斷標準。以及檢測的基因突變和非突變家系成員患惡性腫瘤的臨床病理特點，分析評價中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系的基因突變與臨床表型的關系。 方法：取31個符合中國人遺傳性非息肉性結直腸癌標準的遺傳性非息肉性結直腸癌家系腫瘤先證者外周血DNA樣品，應用聚合酶鏈式反應及變性高效液相色譜儀篩查hMLH1和hMSH2基因的突變，然后對變性高效液相色譜儀圖形異常的樣本進行測序。以Amsterdam標準、Japanese標準、Bet

13、hesda指導、Chinese標準分為4組，觀察每組基因突變情況。以及檢測的基因突變和非突變家系成員患惡性腫瘤的臨床病理特點。 結果：31個符合中國人遺傳性非息肉性結直腸癌標準的家系腫瘤先證者中共檢出分屬于17個不同家系的23個堿基變異位點，經DNA序列分析，共證實外顯子突變10個(10/31，32.9％)，其中3個為同義突變未引起蛋白質序列的改變，另外7個為病理性改變，分別為3個錯義突變、2個無義突變、2個移碼突變。10個突變

14、中7個突變位點(其中病理性突變4個)均為首次報道。另在外顯子區(qū)還檢測到5個已知SNP，內含子區(qū)檢測到8個堿基改變，其中5個為已知SNP，3個意義尚不明確。兩個家系成員有突變，其中一個家系成員中5個成員存在相同突變，其中一個確診結腸癌，4個攜帶者。另一個家系成員中3個攜帶。31個家系在不同標準預示突變敏感方面，符合Japanese標準組發(fā)現突變占89.5％。Bethesda指導組和Chinese標準組其次，均為74.2％。Amsterda

15、m標準組發(fā)現突變占比例最低，為61.5％。經過統(tǒng)計學分析不同標準預示突變率差異無顯著性(P＞0.05)。基因突變與臨床表型結果分析差異無顯著性(P＞0.05)。 結論：(1)變性高效液相色譜儀檢測hMLH1、hMSH2基因雜合性突變高效、簡便、重復性好。(2)符合中國人遺傳性非息肉性結直腸癌標準家系約有1/3可檢出hMLH1、hMSH2基因遺傳性種系突變，其中錯義突變、同義突變較多見。(3)中國人遺傳性非息肉性結直腸癌家系標準即

16、能體現遺傳性非息肉性結直腸癌家系普遍的臨床特征，也能反映出中國人群及腫瘤瘤譜的一些特征。 第三部分中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系的收集整理和永生化細胞系的建立 目的：收集、整理符合中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌診斷標準的31個家系成員，盡最大可能提取外周血，建立永生化細胞系。 方法：按照中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌診斷標準，收集、整理31個家系，其中27例為浙江省內，4例為其他省市。31個家系共有成員329

17、例，簽署知情同意書并提取外周血者251例，EDTA抗凝管共收集外周血5-8ml低溫保存，應用淋巴細胞分離液提取淋巴細胞，EB病毒轉化同時加入環(huán)孢素A制成永生化細胞株，觀察建株成功率。 結果：成功提取外周血者占所有家系成員的76.3％，轉化成功218個樣品，轉化成功率為93.2％，建株成功208個樣品，建株成功率82.9％，建株的平均時間是18天。 結論：首次建立中國人遺傳性非息肉病性結直腸癌家系永生化細胞株，對人類遺傳學