指狀青霉MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Pdmfs2的克隆及功能研究.pdf

1、指狀青霉（Penicillium digitatum）是柑橘類水果的主要致病真菌，在采摘后的加工、貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中引起綠霉病而造成巨大損失。甾醇14α-脫甲基化酶抑制劑(DMIs)具有良好的殺真菌效果，但是抗藥性菌株的出現(xiàn)使得綠霉病的防治更加復(fù)雜且困難。面對這種情況，研究病原真菌的DMIs抗性分子機(jī)理具有十分重要意義。對于DMIs抗性分子機(jī)制的深入理解為發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)及開發(fā)新型高效藥物提供基礎(chǔ)。MFS超家族蛋白(major fa

2、cilitator superfamily)是普遍存在于整個生物界的一大類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有非常廣泛的生理功能。許多MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合特異性較低，能夠運(yùn)輸多種底物。研究發(fā)現(xiàn)，微生物中這類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過量表達(dá)可能導(dǎo)致多藥抗性。
　　本文克隆了指狀青霉中一個新的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因——Pdmfs2，探討了該基因與指狀青霉對咪酰胺藥物抗性之間的關(guān)系，并進(jìn)一步研究了Pdmfs2的其它功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、在指狀青霉中發(fā)

3、現(xiàn)了一個新的MFS超家族蛋白基因，命名為Pdmfs2。該基因全長2115 bp，在211-261 bp、333-388 bp、681-731 bp、804-865 bp及1571-1875 bp處分別含有長度為51、56、51、62和305bp的內(nèi)含子序列。Pdmfs2開放閱讀框長1590 bp，編碼一個含有529氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。PdMFS2與其它真菌中的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性較高，并且具有MFS1結(jié)構(gòu)域。Pdmfs2是指狀青霉中報道

4、的第二個MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
　　2、利用熒光定量PCR進(jìn)行了Pdmfs2基因的轉(zhuǎn)錄水平分析。對于Pdmfs2的本底表達(dá)水平，咪酰胺抗性菌株P(guān)dHS-F6高于咪酰胺敏感菌株P(guān)dHS-E3，PdHS-F6中Pdmfs2基因的本底轉(zhuǎn)錄水平是PdHS-E3的1.73倍。采用7.0μg/mL咪酰胺藥物處理PdHS-F6菌株后Pdmfs2基因的表達(dá)水平上調(diào)至處理前的2.37倍，說明Pdmfs2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以被咪酰胺誘導(dǎo)。
　　3、通過

5、根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的指狀青霉遺傳轉(zhuǎn)化體系，成功構(gòu)建了Pdmfs2基因敲除（ΔPdmfs2）以及基因回補(bǔ)（COPdmfs2）突變菌株。PdHS-F6菌株中Pdmfs2基因的缺失導(dǎo)致對于咪酰胺藥物的敏感性增加，并且ΔPdmfs2菌株中Pdmfs2基因的回補(bǔ)很大程度恢復(fù)了指狀青霉的咪酰胺抗性。PdHS-F6野生型菌株對咪酰胺藥物的EC50值為7.896 mg/L，而ΔPdmfs2菌株的EC50值下降為6.782 mg/L; COPdmfs2菌株的

6、EC50值為7.813mg/L。在含有5.0μg/mL和10.0μg/mL咪酰胺的PDA培養(yǎng)基平板上，ΔPdmfs2菌株的生長直徑小于PdHS-F6及COPdmfs2菌株。這些結(jié)果表明Pdmfs2基因與指狀青霉對于咪酰胺的抗性相關(guān)，其編碼蛋白起著藥物外排泵的作用。
　　4、對野生型PdHS-F6、突變型ΔPdmfs2及COPdmfs2菌株的產(chǎn)孢率進(jìn)行分析，探究了Pdmfs2對于指狀青霉產(chǎn)孢的影響。Pdmfs2基因敲除菌株的產(chǎn)孢率顯

7、著小于PdHS-F6野生型菌株，并且ΔPdmfs2中Pdmfs2基因回補(bǔ)很大程度恢復(fù)了菌株的產(chǎn)孢率。PdHS-F6菌株中Pdmfs2基因的缺失導(dǎo)致產(chǎn)孢率下降約29％，說明Pdmfs2是指狀青霉產(chǎn)孢過程所必需的基因。
　　5、在柑橘水果表皮進(jìn)行指狀青霉侵染毒力測試。接種指狀青霉孢子懸液于柑橘水果的表皮并培養(yǎng)3d后，ΔPdmfs2菌株孢子在柑橘水果表面所產(chǎn)生的病斑直徑為4.48 cm，小于PdHS-F6野生型菌株孢子產(chǎn)生的5.48 c