應(yīng)用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)探索性研究ALK+非小細(xì)胞肺癌血清特異性多肽.pdf

1、背景：
　　1.2007年，研究者發(fā)現(xiàn)在一部分非小細(xì)胞肺癌患者中存在棘皮動物微管相關(guān)蛋白4-間變性淋巴瘤激酶（EML4-ALK）基因存在重排現(xiàn)象，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這種EML4-ALK融合基因是又一種特異性的驅(qū)動基因，這種基因?qū)е履[瘤發(fā)生、發(fā)展的；這種基因重排發(fā)生在2號染色體短臂上，到現(xiàn)在為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種的框內(nèi)融合類型，所有的類型中均為相同的 ALK斷裂位點與不同 EML4斷裂位點之間的融合。蛋白融合后，酪氨酸激酶持續(xù)活化，導(dǎo)致下游細(xì)

2、胞信號的持續(xù)激活。因此，ALK已經(jīng)成為靶向治療的新的靶點。準(zhǔn)確的檢測出ALK融合突變對于臨床來說是至關(guān)重要的。肺腺癌及含有腺癌成分的非小細(xì)胞肺癌均推薦進(jìn)行EML4-ALL融合基因檢測。
　　2.EML4-ALK融合突變的NSCLC患者接受克唑替尼治療時取得了非常令人滿意的臨床療效，但是我們發(fā)現(xiàn)在治療過程中仍有一小部分患者病情出現(xiàn)快速進(jìn)展。因此能否在治療初期對患者療效多角度進(jìn)行評估預(yù)測對于臨床治療策略的制定來說至關(guān)重要，也更加符合個

3、體化治療的要求。
　　最近幾年，人們對蛋白質(zhì)組學(xué)的研究取得了飛速的進(jìn)展。其中以體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究為代表，因其取材容易，也成為臨床研究者主要的關(guān)注點之一，其中血清（漿）、尿液、腦脊液、唾液等體液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究取得了一定成果。
　　目的：MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一項新技術(shù)，這項技術(shù)靈敏度高，能夠完成高通量檢測，操作簡單快捷，而且具有很好的再現(xiàn)性、穩(wěn)定性。在這項研究中，預(yù)期應(yīng)用MALDI-TOF-MS質(zhì)

4、譜分析技術(shù)聯(lián)合銅離子納米螯合磁珠對ALK+非小細(xì)胞肺癌患者血清低豐度蛋白進(jìn)行研究，試圖發(fā)現(xiàn)一組特異性血清多肽。其次，同樣應(yīng)用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對克唑替尼療效進(jìn)行研究，對接受克唑替尼治療的晚期NSCLC患者血清多肽進(jìn)行分析，預(yù)期發(fā)現(xiàn)一組有療效相關(guān)的蛋白或多肽。
　　方法：
　　1.患者血標(biāo)本來源于2012年8月至2014年10月在我院肺部腫瘤科就診的非小細(xì)胞肺癌患者。留取患者血標(biāo)本的同時留取患者組織標(biāo)本并進(jìn)行FISH檢

5、測，根據(jù)FISH檢測結(jié)果將患者分為ALK+組與ALK-組。經(jīng)過篩選，最終入組患者101名， ALK+組50名，ALK-組51名。經(jīng)上述患者隨機(jī)分組，分為訓(xùn)練組和驗證組，其中訓(xùn)練組包括30例ALK+患者和30例ALK-患者血清標(biāo)本，這組患者用來建立分類診斷模型；測試組包括20例ALK+患者和21例ALK-患者血清標(biāo)本，這組患者對上述模型進(jìn)行盲法驗證。上述患者的血清經(jīng)銅離子螯合納米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）提取血清低豐度蛋白，然后通過

6、MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測，對蛋白/多肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中建模組血清多肽用來建立診斷模型。驗證組血清多肽提取后帶入診斷模型進(jìn)行驗證。
　　2.對接受克唑替尼治療的晚期NSCLC患者進(jìn)行隨訪，留取患者基線血標(biāo)本。隨訪患者的近期療效，其中療效評價為PR、CR、SD的患者定義為疾病控制組，療效評價為PD的患者定義為疾病進(jìn)展組，對這兩組患者的基線血標(biāo)本進(jìn)行多肽提取并進(jìn)行質(zhì)譜檢測，找出控制組和進(jìn)展組患者之間的

7、血清差異多肽，用這組多肽來建立診斷模型，最后用驗證組患者的血清進(jìn)行驗證。
　　3.臨床階段研究：根據(jù)上述療效預(yù)測模型，收集EML4-ALK融合突變患者治療前血清，通過分類模型預(yù)測為克唑替尼優(yōu)效組合劣效組。上述兩組患者均一線口服克唑替尼靶向治療，對患者進(jìn)行療效評價以及生存隨訪，研究終點為PFS。
　　結(jié)果：
　　1.研究發(fā)現(xiàn)ALK+NSCLC患者與ALK-NSCLC患者血清存在差異多肽，共發(fā)現(xiàn)115個差異多肽峰，質(zhì)荷比（

8、m/z）均集中在800-10,000Da范圍。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)有90個多肽峰（定義兩組P＜0.05的多肽峰具有統(tǒng)計學(xué)差異）具有統(tǒng)計學(xué)差異。59個在ALK+血清中高表達(dá)，31個在ALK-血清中高表達(dá)。運用三種算法建立診斷模型，并篩選出 GA算法為最優(yōu)算法，5個多肽峰（7477.49Da，7406.42Da，7655.84 Da，6053.24Da，9307.35 Da）建立分類模型，然后對測試組進(jìn)行驗證，該模型準(zhǔn)確率為85.73％（34

9、/41），敏感性為70%（14/20），特異性達(dá)100%(21/21)。
　　2.接受克唑替尼治療的NSCLC患者中共有50人符合入組標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)隨訪結(jié)果分為疾病控制組25例，療效評價為CR+PR+SD；疾病進(jìn)展組25例，療效評價為PD。然后將上述血清標(biāo)本隨機(jī)分組：分為訓(xùn)練組和驗證組，訓(xùn)練組患者的血清多肽識別后用以建立診斷模型；驗證組患者的血清多肽提取后對診斷模型進(jìn)行盲法驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)多肽提取及質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)了疾病控制組和疾病進(jìn)展

10、組患者之間存在血清多肽差異，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)62個多肽峰存在統(tǒng)計學(xué)差異，其中41個在控制組患者的血清中高表達(dá)，21個在進(jìn)展組患者的血清中高表達(dá)，經(jīng)三種算法建模分析后選取 GA算法為最優(yōu)算法，并篩選出5個多肽峰（1046,1277,2768,6636,6858Da）建立診斷模型，然后進(jìn)行盲樣驗證，得到敏感性80%（8/10），特異性60%（6/10），準(zhǔn)確率60%（6/10）。
　　3.臨床階段研究發(fā)現(xiàn)接受克唑替尼治療的患者治療初

11、期進(jìn)行血清多肽提取帶入分類模型，分為控制組和進(jìn)展組，對兩組患者的生存隨訪發(fā)現(xiàn)，控制組患者中位PFS10個月，進(jìn)展組患者中位PFS5個月，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.本研究初步揭示了ALK+與ALK-非小細(xì)胞肺癌患者血清存在明顯的多肽差異，這些差異多肽或可作為ALK檢測有潛在價值的生物標(biāo)志物，后期可進(jìn)一步對這些多肽進(jìn)行身份識別及功能研究。本研究建立了ALK+與ALK-NSCLS血清分類識別模型，經(jīng)驗證該模型經(jīng)驗證后具