LIPUS加速大鼠正畸牙槽骨改建過程中BMP-2相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制探討.pdf

1、加速牙槽骨改建進(jìn)而加快正畸牙齒移動(dòng)速度是正畸醫(yī)生和正畸患者最盼望的事情。牙齒移動(dòng)與應(yīng)用正畸力的反應(yīng)密切相關(guān),而正畸力是牙周組織改建特別是牙槽骨改建的關(guān)鍵因素。牙周膜是牙槽骨與牙骨質(zhì)之間一層薄薄的致密結(jié)締組織,有自我更新和修復(fù)能力,在維持牙周組織動(dòng)態(tài)平衡方面起著十分重要的作用。人類牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)具有多向分化潛能,并且在牙槽骨改建過程中起重要作用。低強(qiáng)度脈沖超聲(

2、Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)刺激已經(jīng)被報(bào)道為促進(jìn)骨折愈合和治療骨不連等疾病,并且可以在牽張成骨術(shù)后加速骨的成熟和改建的速度。骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是多功能的生長(zhǎng)因子,作為成骨誘導(dǎo)的信號(hào)蛋白,它們不僅引起多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等功能,而且可以參與組織的再生和修復(fù),特別是在骨組織的改建過程中發(fā)揮著非常重要的作用,其中以BMP-2誘骨活

3、性最強(qiáng)。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor,HGF)可以刺激成骨細(xì)胞的增殖以及分化,并且HGF在介導(dǎo)骨形成的過程中可能有激活成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2(Runt-related transcription factor2,Runx2)的作用。Runx2是一種成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子,在成骨細(xì)胞的形成以及分化,破骨細(xì)胞的形成和活化等過程中都發(fā)揮著重要的作用,此外,Runx2的信號(hào)通路可能參與了LIPUS刺激增加了B

4、MP-2的表達(dá)。受活化的NFκB的配體(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)是調(diào)控破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因子,并且可以參與正畸過程中牙槽骨的改建。
　　研究目的:
　　LIPUS刺激對(duì)HGF/Runx2/BMP-2信號(hào)通路以及RANKL表達(dá)的影響,以及它們是否加速了牙槽骨改建等類似研究非常有限,本研究旨在探討在大鼠正畸牙齒移動(dòng)過程中LIPUS刺激對(duì)這

5、些因子表達(dá)的影響。
　　研究方法:
　　1.在大鼠的上頜第一磨牙和中切牙間放置正畸裝置,所有大鼠在安放牙齒移動(dòng)裝置后的第2天開始對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)上頜第一磨牙處進(jìn)行LIPUS刺激。觀察刺激后第0,1,3,5,7,14天大鼠上頜第一磨牙移動(dòng)距離以及上頜第一磨牙牙齦表面溫度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化,同時(shí)觀察各組大鼠上頜第一磨牙張力側(cè)牙周組織BMP-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。
　　2.觀察第0,3,7天大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織HE染

6、色,用qRT-PCR法和Western blot(WB)檢測(cè)LIPUS刺激第0,3,7天大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織RANKL mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3.用qRT-PCR法和WB法檢測(cè)LIPUS刺激第0,3,7天大鼠上頜第一磨牙張力側(cè)牙周組織HGF,Runx2,BMP-2的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　4.原代培養(yǎng)和鑒定人類牙周膜細(xì)胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs),并

7、且對(duì)其進(jìn)行LIPUS刺激。qRT-PCR法和WB法檢測(cè)LIPUS刺激第0,1,3,5,7,14天后hPDLCs中BMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　5.將hPDLCs在含有0 ng/ml,5ng/ml,10ng/ml濃度HGF的培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24 h,qRT-PCR法檢測(cè)hPDLCs中BMP-2mRNA的表達(dá),WB法檢測(cè)培養(yǎng)48h后hPDLCs中BMP-2蛋白的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染了Runx2 siRNA以及control si

8、RNA的hPDLCs在37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,用qRT-PCR法和WB法檢測(cè)LIPUS刺激5天后各組BMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　6.觀察LIPUS刺激hPDLCs第0,1,3,5,7,14天后,對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組hPDLCs增殖的影響。將培養(yǎng)hPDLCs的6孔板分別在37℃,38℃,39℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后,qRT-PCR法和WB法檢測(cè)hPDLCs中BMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)

9、果:
　　1.實(shí)驗(yàn)組大鼠正畸過程中牙齒移動(dòng)的量在第5,7,14天明顯超過對(duì)照組(P<0.05)。定量分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組BMP-2免疫組織化學(xué)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)組第3天,5天,7天和14天BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組數(shù)目明顯增加(P<0.05)。在LIPUS刺激過程中,牙齦表面的溫度有一定幅度的上升。
　　2.根據(jù)HE染色結(jié)果,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組LIPUS刺激在第3天增加了破骨細(xì)胞的數(shù)目(P<0.05),而在第7天顯著增加了破骨細(xì)胞

10、的數(shù)目(P<0.01)。大鼠上頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織在LIPUS刺激下的RANKL的mRNA以及蛋白表達(dá)在第3天比對(duì)照組有顯著增加(P<0.01),而第7天比對(duì)照組有非常顯著增加(P<0.001)。
　　3.大鼠上頜第一磨牙張力側(cè)牙周組織在LIPUS刺激下的HGF,Runx2,BMP-2的mRNA以及蛋白的表達(dá)在第3天比對(duì)照組增加(P<0.05),而第7天比對(duì)照組有顯著增加(P<0.01)。
　　4.hPDLCs中BMP-

11、2的mRNA以及蛋白的表達(dá)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而明顯升高,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的BMP-2 mRNA在第3-14天的表達(dá)顯著增加,在第7天達(dá)到高峰,并且一直到第14天持續(xù)升高(P<0.05)。
　　5.hPDLCs在含有5ng/mlHGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)之后BMP-2mRNA的表達(dá)量以及蛋白表達(dá)量有增加(P<0.05),而在含有10ng/ml HGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后則有顯著增加(P<0.01)。用Runx2 siRNA

12、預(yù)處理的hPDLCs和對(duì)照組相比,在LIPUS刺激下減少了BMP-2mRNA和蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組hPDLCs在第0,1,3,5,7,14天并沒有明顯的差別,即LIPUS刺激對(duì)hPDLCs的增殖沒有影響(P>0.05)。同時(shí)隨著培養(yǎng)溫度的升高,hPDLCs中BMP-2 mRNA以及蛋白的表達(dá)并沒有明顯的改變(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,在大鼠正畸牙齒移動(dòng)