小鼠胚胎成纖維細胞重編程過程中p53、MDM2、Aurka基因相關性的實驗研究.pdf

1、目的:研究攜帶有轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的腺病毒感染小鼠胚胎成纖維細胞(MEFc)，通過誘導出誘導多能干細胞
　?。╥PSC），并分析在重編程過程中p53基因、MDM2基因、Aurka基因的變化規(guī)律，為提高誘導多能干細胞誘導效率提供思路。
　　方法：1.對前期凍存的MEFc進行復蘇，待MEFc生長良好后，加入帶有4個轉(zhuǎn)錄因子（OSCK）的腺病毒，反復感染兩次后，觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；2.對誘導出的

2、細胞進行多能性鑒定：通過對細胞形態(tài)學觀察、成瘤性、堿性磷酸酶(偶氮偶聯(lián)法)染色，及干細胞標志基因檢測；3.將轉(zhuǎn)染的細胞分別按照誘導前、誘導后24h、誘導后1w、誘導后2w四個時間段，利用Real-Time PCR技術，多次測量p53基因、MDM2基因、Aurka基因的轉(zhuǎn)錄情況。實驗數(shù)據(jù)應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各個基因內(nèi)各個時間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，統(tǒng)計學檢驗標準為P<0.05。
　　結(jié)果：1.對誘導的細胞進行多

3、能性鑒定：a、形態(tài)學變化：可觀察到細胞邊界輪廓清楚，胞體較小鼠成纖維細胞變大，變圓，長度變短，少數(shù)呈多變性，仍有明顯突起，但突起長度變短。b、成瘤性觀察：約7-8周后可見到大鼠根部明顯2-3個畸胎瘤，用手觸及包塊質(zhì)中等硬度，可滑動，與周圍組織無粘連，表面光滑。取出包塊組織，可見到包塊淡紅色塊橢圓形柱狀物，大小為約1cm×0.5cm×0.3cm。將取下的組織行切片、HE染色處理，可見細胞核成藍色，胞質(zhì)成粉紅色，在中可見到大量杯狀細胞組成的

4、腺體組織、血管、大量的脂肪組織。c、堿性磷酸酶鑒定：可見大量堿性磷酸酶陽性顆粒。d、干細胞標志基因檢測：Oct4、Sox2及Nanog在誘導的細胞中均有表達。2.在誘導過程中p53轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律：1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w、轉(zhuǎn)染后2w比較，相對表達量差異顯著（P<0.05）。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3.轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.0

5、5)。p53的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后24h既出現(xiàn)升高，在轉(zhuǎn)染1w后較高，而在轉(zhuǎn)染2w后出現(xiàn)下降。在誘導過程中MDM2轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w、轉(zhuǎn)染后2w比較，RQ差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3、轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后兩周比較，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MDM2的轉(zhuǎn)錄在四因子腺病毒轉(zhuǎn)染后24h出現(xiàn)下

6、降，1w時下降明顯，而在轉(zhuǎn)染2w后卻出現(xiàn)升高。與p53基因的變化規(guī)律成反比。在誘導過程中AURKA轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律:1、轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后24h、轉(zhuǎn)染后1w，RQ差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與轉(zhuǎn)染后2w比較， RQ差異不顯著（P>0.05）。2、轉(zhuǎn)染后24h與轉(zhuǎn)染后1w及轉(zhuǎn)染后2w比較，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3、轉(zhuǎn)染后1w與轉(zhuǎn)染后2w比較，差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？烧J為Aurka的轉(zhuǎn)錄在四因子

7、腺病毒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)明顯升高，1w時較轉(zhuǎn)染后仍高，而在轉(zhuǎn)染2w呈現(xiàn)與正常水平,且Aurka的轉(zhuǎn)錄升高水平明顯高于p53基因。通過利用MDM2與Aurka的抑制劑發(fā)現(xiàn)細胞p53蛋白表達均明顯升高。
　　結(jié)論1.細胞的重編程過程能夠激活p53信號通路，p53轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)染2w后出現(xiàn)下降，考慮重編程已經(jīng)完成，可考慮干預重編程過程的時間在2w內(nèi)。2.細胞重編程過程中MDM2水平下降，通過利用MDM2拮抗劑在誘導多能干細胞中發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達明顯增