基于NF-κB通路探討清熱解毒涼血化瘀法聯合骨髓間充質干細胞移植治療急性肝衰竭模型大鼠的作用機制.pdf

1、研究目的：
　　采用全骨髓貼壁法篩選大鼠骨髓間充質干細胞，并進行傳代培養(yǎng)及鑒定，同時制備急性肝衰竭伴內毒素血癥模型大鼠，通過觀察清熱解毒涼血化瘀中藥聯合BMSCs移植對模型大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉錄及肝組織中核因子NF-κB表達的影響來探討該聯合方法對急性肝衰竭時炎癥反應的作用機制。
　　研究方法：
　　1.大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代篩選：無菌條件下取出大鼠雙側股骨及脛骨，并在超凈工作臺中沖洗出骨髓

2、，接種于含10％胎牛血清的培養(yǎng)基中，定期換液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況,并對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　2.急性肝衰竭大鼠模型的建立并驗證
　　取體重約為180g-200g健康級SD雄性大鼠，硫代乙酞胺（TAA）以400mg/(kg2d)的劑量灌胃，間隔24h后重復給藥1次。設置正常組，給予2ml生理鹽水灌胃。造模48h后將存活的大鼠采血、取肝，以檢測血清肝功指標和血漿內毒素水平，制作肝組織病理切片，鏡下觀察肝臟結

3、構及炎性細胞浸潤情況，對比正常組，以驗證造模是否成功。
　　3.急性肝衰竭大鼠實驗分組及干預
　　體重約為180g-200g健康級SD雄性大鼠60只，隨機分為正常組（A組）、TAA模型組（B組）、TAA+甘草酸苷治療組（C組）、TAA+中藥治療組（D組）、TAA+BMSCs治療組（E組）、TAA+BMSCs+中藥組治療組（F組），每組10只。B組、C組、D組、E組、F組給予400mg/kgTAA灌胃，間隔24h后重復給藥1次

4、，制備ALF大鼠模型。A組給予2ml生理鹽水灌胃。第2次灌胃后將BMSC（約1x107個細胞/只）經尾靜脈注射到E、F組大鼠體內，A、B、C、D組大鼠經尾靜脈注射等體積的用于培養(yǎng)BMSC的培養(yǎng)液，24h后重復尾靜脈注射1次。第1次尾靜脈注射后立即予以D、F組大鼠茵陳四苓顆粒灌胃；C組予以甘草酸苷灌胃；A組、B組、E組予以等體積蒸餾水灌胃。干預治療72h后采血、取肝，檢測血清肝功指標、血漿內毒素含量；免疫組化法檢測肝組織中NF-κB的表達

5、；RT-PCR法檢測肝組織TNF-α、iNOS的基因轉錄情況。
　　研究結果：
　　1.成功分離出貼壁生長的細胞，經過3次傳代篩選后細胞形態(tài)逐漸趨向一致，以梭形為主，呈旋渦狀、網狀或放射狀排列。P3代細胞經流式細胞儀鑒定結果顯示：CD29、CD44細胞陽性率分別為98.2%和97.9%，而CD34、CD45細胞陽性率分別為12.9%和18.7%，符合骨髓間充質干細胞表面抗原表達的特點。
　　2.急性肝衰竭模型的驗證：T

6、AA模型組血清AST、ALT及血漿內毒素水平較正常組均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。TAA模型組肝組織HE染色顯示：肝索結構大部分被破壞，肝細胞出現片狀壞死、凋亡，大量炎癥細胞浸潤。正常組肝組織HE染色：肝組織細胞排列規(guī)律，結構規(guī)整，細胞形態(tài)正常，無炎癥細胞浸潤。
　　3.急性肝衰竭模型大鼠經干預后的情況：
　?。?）ALT、AST及內毒素水平結果顯示：采取治療的4組（C、D、E、F）大鼠血清 AST、ALT及

7、血漿內毒素水平明顯低于模型組（B組），差異有統計學意義（P<0.01）；但各治療組與正常組（A組）對比，AST、ALT、內毒素水平仍高，差異有統計學意義（P<0.01）；各治療組相比較，F組大鼠血清AST、ALT及血漿內毒素水平較C、D、E組低，差異有統計學意義（P<0.01）；C、D、E三組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
　?。?）RT-PCR結果顯示：A組肝組織中有少量TNF-α、iNOS的基因轉錄。B、C、D、

8、E、F組與A組相比，TNF-α、iNOS的基因轉錄水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。采取治療措施的C、D、E、F組大鼠肝組織中TNF-α、iNOS的基因轉錄水平均明顯低于模型組（B組），差異有統計學意義（P<0.01）；各治療組間比較，F組TNF-α、iNOS的基因轉錄水平較 C、D、E三組低，差異有統計學意義（P<0.01）；C、D、E三組TNF-α、iNOS的基因轉錄水平差異無統計學意義（P>0.05）。
　　（

9、3）免疫組化結果顯示：A組肝組織有少量細胞的胞質或胞核內可見NF-κB的表達。灌胃TAA的其他五組與A組相比較，表達NF-κB的細胞數目明顯增多，差異具有顯著統計學意義（P<0.01）。經干預后，各治療組（C、D、E、F組）與模型組（B組）相比，NF-κB表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01），與A組相比，NF-κB表達仍然很高，差異有統計學意義（P<0.01）。各治療組間比較，F組表達NF-κB的細胞數目較C、D、E組有所減少

10、，差異有統計學意義（P<0.05），而C、E、F三組表達NF-κB的細胞數目相近，差異無統計學意義（P>0.05）。
　　研究結論：
　　1.采用全骨髓培養(yǎng)法可成功獲得較高純度的BMSCs，且該方法簡便、快捷、經濟，可作為實驗室分離提取BMSCs的常用方法。
　　2.以400mg/(kg2d)劑量的TAA灌胃，每天1次，共灌胃2天，能夠成功建立急性肝衰竭伴內毒素血癥大鼠模型。
　　3.肝衰竭時茵陳四苓顆粒、BMS

11、Cs移植均能夠降低血漿內毒素含量，兩者聯合效果更明顯。
　　4.肝衰竭時陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠抑制NF-KB的激活，兩者聯合效果更明顯。
　　5.肝衰竭時茵陳四苓顆粒、BMSCs移植均能夠減少炎性因子TNF-α、iNOS生成減少，兩者聯合效果更明顯
　　6.茵陳四苓顆粒聯合BMSCs移植能夠明顯減輕肝衰竭時肝內失控性炎癥反應，其機制可能是與減少內毒素的生成及吸收，抑制炎癥信號通路NF-KB激活，從而減少其下游