兩種富血小板纖維蛋白對人牙齦成纖維細(xì)胞的生長速度及質(zhì)量影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　通過實(shí)驗(yàn)，對比兩種富血小板纖維蛋白,即改良型富血小板纖維蛋白（Advanced Platelet-Rich Fibrin,A-PRF)和富血小板纖維蛋白（Platelet-Rich Fibrin,PRF），與人牙齦成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)后對其生長速度及質(zhì)量的影響，分析自體血液通過不同離心參數(shù)所得的兩種生物材料各自在影響牙齦生長過程中的特點(diǎn)，為臨床中選擇對口腔局部軟組織缺損再生修復(fù)和重塑材料，提供參考。
　　方法：

2、r>　　1.人牙齦成纖維細(xì)胞的獲得、培養(yǎng)及鑒定：臨床上收集8例下頜阻生智齒患者拔牙時切取的齦瓣，以MEM培養(yǎng)基進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，取第三代細(xì)胞進(jìn)行鼠抗人 Vimentin單抗、鼠抗人cytokeratin單抗染色,鑒定是否為成纖維細(xì)胞。當(dāng)原代細(xì)胞生長至80~90％融合時，開始進(jìn)行傳代。
　　2.制備PRF及A-PRF膜：抽取對應(yīng)的牙齦提供者的肘靜脈血每管5ml，以1500rpm，14min和2700rpm，12min分別離心獲得A-P

3、RF及PRF凝膠，專用工具盒壓制成膜，縱向?qū)ΨQ裁剪成4等份，稱重，修剪至質(zhì)量相等。
　　3.A-PRF膜、PRF膜與細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)設(shè)置分為A-PRF組、PRF組、空白組，同時調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×104個/ml，A-PRF組平鋪A-PRF膜于培養(yǎng)板底部，PRF組平鋪PRF膜于培養(yǎng)板底部，三組分別加入1000ul細(xì)胞懸液。
　　4.于細(xì)胞加入后的1、3、5、7天，三組分別進(jìn)行CCK-8檢測，測定細(xì)胞增殖活性。
　　5

4、.于細(xì)胞加入后的1、3、5、7天，三組分別進(jìn)行I型膠原纖維（COL1A1）的PCR檢測。
　　6.于細(xì)胞加入后的1、3、5、7天，A-PRF組與PRF組分別進(jìn)行掃描電鏡檢測。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析CCK-8結(jié)果，PCR檢測結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：8組標(biāo)本均順利取材培養(yǎng)，無污染，組織塊培養(yǎng)第7天，于倒置相差顯微鏡下見部分組織塊周圍有細(xì)胞游離，呈梭形，胞體豐滿邊界清晰；第15天，可見組織塊周圍大量細(xì)胞密集

5、布滿，呈放射狀，層疊狀，較規(guī)律，胞體豐滿邊界清晰。
　　2.細(xì)胞鑒定：取第三代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，8例標(biāo)本全部對抗 Vimentin染色陽性，細(xì)胞核染為藍(lán)色，胞漿染為棕色。8例標(biāo)本對抗cytokeratin染色陰性，細(xì)胞核染為藍(lán)色，胞漿不著色，表明細(xì)胞為間充質(zhì)來源細(xì)胞。
　　3.CCK-8計(jì)數(shù)：第1天，三組之間對比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第3天，A-PRF組與PRF組對比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組分別與空白組對照

6、，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第5天，A-PRF組與PRF組對比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A-PRF組與空白組對照有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），PRF組與空白組對照，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第7天，A-PRF組與空白組對照有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PRF組與空白組對照，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），A-PRF組與PRF組之間對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.PCR檢測Ⅰ型膠原纖維：第1天，三組

7、之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；第3天，A-PRF組相對于PRF組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A-PRF組與PRF組相對于空白組皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且A-PRF組共同培養(yǎng)與空白組對比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；第5天，A-PRF組相對于PRF組和空白組皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PRF組相對于空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第7天，A-PRF組相對于PRF組和空白組皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PRF組

8、相對于空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， A-PRF組與空白組對比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　5.掃描電鏡觀察：接種后第一天，可見完整A-PRF和PRF膜，其中A-PRF膜纖維蛋白呈粗大條索狀交織，PRF膜纖維蛋白呈細(xì)密網(wǎng)絡(luò)狀交織，排列規(guī)則整齊，對比觀察，可見 A-PRF膜纖維蛋白更加粗大褶皺， PRF膜纖維蛋白細(xì)密平整，接種的成纖維細(xì)胞散落在網(wǎng)中，胞體呈圓形邊界清晰，未見明顯黏附痕跡，網(wǎng)絡(luò)間還可見少量紅細(xì)胞嵌入。

9、接種后第三天，A-PRF膜粗大纖維結(jié)構(gòu)仍清晰且較規(guī)律，PRF膜不再致密平整，變得開始凹凸不平。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中少量成纖維細(xì)胞黏附，形態(tài)不再為圓形，形態(tài)扁平且變長，逐漸貼附于纖維蛋白表面。接種后第五天，A-PRF膜表面變得粗糙，仍可隱約見纖維蛋白條索輪廓，PRF膜較第三天更加粗糙，可見小縫隙。成纖維細(xì)胞密度變大，呈梭形或星形，伸出偽足，緊密貼附于纖維蛋白，有的可見偽足深入縫隙之中。接種后第七天，A-PRF膜條索輪廓基本消失，但仍舊有完整結(jié)構(gòu)，纖

10、維蛋白仍細(xì)密交織成網(wǎng)，PRF膜出現(xiàn)缺損。A-PRF和PRF膜表面都大量黏附成纖維細(xì)胞，梭形，偽足嵌入網(wǎng)中，貼附緊密。
　　結(jié)論：
　　1.成纖維細(xì)胞培養(yǎng)鑒定結(jié)果所示，所得細(xì)胞均為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)細(xì)胞，即成纖維細(xì)胞，該實(shí)驗(yàn)方法可行。
　　2.A-PRF、PRF均能提高成纖維細(xì)胞增殖活性，且在3-5天促進(jìn)作用最為明顯，A-PRF總體促進(jìn)效果優(yōu)于PRF。
　　3.在創(chuàng)傷愈合早期（術(shù)后7天內(nèi)），A-PRF促進(jìn)膠原纖維沉積的能力優(yōu)