基質(zhì)硬度對正常人類肝(LO2)細(xì)胞內(nèi)自噬體分布的影響的研究.pdf

1、在各個器官中，細(xì)胞周圍都是柔軟的組織，而不是玻璃，塑料那樣硬的表面，但是幾乎所有的關(guān)于細(xì)胞的實驗都是在玻璃，塑料表面進(jìn)行的，然而細(xì)胞外基質(zhì)硬度會對細(xì)胞產(chǎn)生很大的影響。它能刺激腫瘤的形成，肝癌的形成就是一個很好地例子，由于肝纖維化和肝硬化使得正常肝組織慢慢變硬從而促進(jìn)了肝癌的發(fā)展。此外，自噬在肝臟疾病中也扮演著重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系與正常細(xì)胞系相比較而言自噬水平降低了，暗示自噬在腫瘤的中起到抑制的作用，然而在腫瘤的發(fā)展過程中細(xì)胞外

2、基質(zhì)硬度是否會影響自噬還不清楚。
　　因為LC3-II的含量與自噬體相關(guān)，而且LC3-II出現(xiàn)在自噬過程的各個階段，所以選取LC3作為自噬的標(biāo)記蛋白，但是有研究表明LC3是一種很容易聚集的蛋白，瞬時轉(zhuǎn)染的暫時性過表達(dá)容易引起LC3的聚集，所以構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白LC3的LO2穩(wěn)定細(xì)胞系是必要的。為了研究基底硬度與自噬的關(guān)系，我們構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白LC3的LO2穩(wěn)定細(xì)胞系。我們采用一種相比于傳統(tǒng)方法更方便，高效的方

3、法，將瞬時轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按照2000/孔，1000/孔，500/孔的比例種到96孔板中篩選15天，成功構(gòu)建了4株穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)記蛋白GFP-LC3 LO2單克隆穩(wěn)定細(xì)胞系，選擇其中GFP-LC3表達(dá)量最高的一株進(jìn)行后期的實驗。
　　通過改變固化劑和聚二甲硅氧烷（PDMS）的比例，我們制備出了11 kPa，124 kPa，1220 kPa三種硬度的PDMS基底，將LO2細(xì)胞培養(yǎng)在這三種硬度的基底和塑料表面（作為對照）48小時，接下來用

4、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中自噬體的位置，用免疫印跡法分析LC3-II的表達(dá)量，結(jié)果顯示不管是24小時還是48小時，LC3-II的表達(dá)量并沒有顯著地差異，所以我們推斷基質(zhì)硬度對自噬水平的影響并不大，然而不同硬度的基底卻對LO2細(xì)胞中自噬體的分布影響很大，更具體些，在軟的基底上（11 kPa PDMS基底）培養(yǎng)48小時的LO2細(xì)胞中的自噬體在細(xì)胞核周圍聚集成一個球狀，而硬的基底（1220 kPa PDMS基底）或是塑料基底上的細(xì)胞中的自噬體仍然是