蘋果樹枝多酚類成分降血糖功效研究.pdf

1、目的:
　　1.本課題以蘋果樹枝多酚類成分為研究對象，首先從蘋果樹枝中提取分離精制得到蘋果樹枝多酚類成分的化學部位，并對其降血糖活性進行初步驗證，明確蘋果樹枝多酚類成分是蘋果樹枝降血糖活性的有效部位。
　　2.對篩選出的蘋果樹枝多酚類成分活性部位進行系統(tǒng)分離。以期獲得蘋果樹枝多酚類成分降血糖功效的藥效物質基礎。
　　3.對蘋果樹枝多酚類成分的質量控制方法進行初步研究，包括總多酚及總黃酮的含量測定。
　　4.對蘋果

2、樹枝多酚類成分的降血糖功效進行深入研究。包括其對血糖、膽固醇、甘油三酯、口服葡萄糖、淀粉、蔗糖耐受量的影響，以及對胰島RIN-m5fβ細胞的作用等。
　　方法:
　　1.蘋果樹枝原料用5倍量的體積分數為80％乙醇水溶液于90℃回流提取2次，每次30min。
　　采用816型大孔樹脂為柱色譜填料，以水、40％乙醇、60％乙醇、95％乙醇為洗脫溶劑，將蘋果樹枝粗提物分離精制為不同的化學部分。
　　利用Folin-Ci

3、ocalteu比色法測定各個化學部分的總多酚含量，篩選出多酚含量最高的化學部分。
　　采用小劑量鏈脲佐菌素誘導的糖尿病ICR小鼠模型對篩選出的化學部分的降血糖活性進行初步驗證。
　　2.采用多種色譜法如硅膠柱色譜、開放ODS柱色譜、制備型反相HPLC等分離方法對篩選出的蘋果樹枝多酚類化學部分進行系統(tǒng)分離。通過共薄層、理化性質和EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、COSY等譜學方法對分離得到的單體成分

4、的平面結構及立體結構進行確定。
　　3.通過UV法對篩選出的蘋果樹枝多酚類化學部分的質量控制方法進行研究。選用簡便、快速、易行的NaNO2-Al(NO3)3顯色法對其總黃酮含量進行測定。
　　4.建立多次小劑量鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型，并隨機分組，給予蘋果樹枝多酚類成分一周后尾靜脈取血，利用葡萄糖試劑盒、甘油三酯和總膽固醇試劑盒測定其對血糖、甘油三酯和總膽固醇的影響。測定糖尿病小鼠灌服葡萄糖、蔗糖和淀粉0、1及2h血糖

5、值，與模型對照組、陽性對照組比較，確定其對糖尿病小鼠的糖耐量的影響。
　　另外采MTT法測定蘋果樹枝多酚類成分對胰島RIN-m5fβ細胞的影響。
　　結果:
　　1.實驗結果顯示水部分、40％乙醇部分、60％乙醇部分、95％乙醇部分總多酚含量依次為3774.5μg/g、4320.9μg/g、6918.6μg/g、1305.5μg/g，其中60％乙醇部分總多酚含量最高。另外蘋果樹枝提取物60％乙醇部分在給藥2h后對小劑量

6、鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠具有很好的降血糖作用。
　　2.共從蘋果樹枝60％乙醇部分分離并鑒定了8個多酚類單體化合物，分別為:phloridzin,(1)4-hydroxybenzoic acid,(2) protocatechuic acid methylester,(3) cinnamic acid,(4)6-methoxy quercetin,(5)6-methoxy quercetin-3-O-α-L-rhamno-pyr

7、anoside，(6) phloretin(7) quercetin，(8)其中化合物2、3、5、6為首次從該植物中分離得到。
　　3.本實驗建立的NaNO2-Al(NO3)3顯色法平均回收率為102.78％，平均相對標準偏差為1.68％，所用方法簡便、快速、易行，精密度考察、穩(wěn)定性考察、重現性試驗及線性關系考察均符合要求，可用于蘋果樹枝60％乙醇部分的總黃酮的質量控制。實驗結果顯示，蘋果樹枝60％乙醇部分的總黃酮含量高達15.7

8、8mg/g。NaNO2-Al(NO3)3顯色法的原理是在堿性條件下，絡合反應發(fā)生在黃酮B環(huán)的3'，4'-鄰二酚羥基部位，一些不帶鄰二酚羥基的黃酮類化合物（如根皮苷、根皮素等）不能通過此方法檢測到，因此在蘋果樹枝60％乙醇部分中總黃酮的含量可能更高。
　　4.運用糖尿病動物模型對蘋果樹枝提取物60％乙醇部分的降血糖功效進行了進一步研究。結果表明，蘋果樹枝提取物在給藥一段時間后，對小劑量鏈脲佐菌素誘導的糖尿病ICR小鼠有良好的降血糖作

9、用;蘋果樹枝提取物給藥一周后能夠明顯降低小劑量鏈脲佐菌素誘導的糖尿病ICR小鼠血液中甘油三脂的含量，而且能夠加快小劑量鏈脲佐菌素誘導的糖尿病ICR小鼠體內葡萄糖的代謝，從而增加糖耐受量。口服葡萄糖、蔗糖、淀粉耐量實驗同樣證明了蘋果樹枝提取物具有良好的降血糖作用。蘋果樹枝提取物60％乙醇部分在高劑量時降血糖作用明顯，低劑量時無作用，且口服葡萄糖、蔗糖、淀粉耐量實驗也沒有抑制血糖升高。
　　同時通過體外實驗，發(fā)現蘋果樹枝提取物60％乙