蘋果樹枝多酚類成分降血糖功效研究.pdf

1、目的:
　　1.本課題以蘋果樹枝多酚類成分為研究對(duì)象，首先從蘋果樹枝中提取分離精制得到蘋果樹枝多酚類成分的化學(xué)部位，并對(duì)其降血糖活性進(jìn)行初步驗(yàn)證，明確蘋果樹枝多酚類成分是蘋果樹枝降血糖活性的有效部位。
　　2.對(duì)篩選出的蘋果樹枝多酚類成分活性部位進(jìn)行系統(tǒng)分離。以期獲得蘋果樹枝多酚類成分降血糖功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　3.對(duì)蘋果樹枝多酚類成分的質(zhì)量控制方法進(jìn)行初步研究，包括總多酚及總黃酮的含量測(cè)定。
　　4.對(duì)蘋果

2、樹枝多酚類成分的降血糖功效進(jìn)行深入研究。包括其對(duì)血糖、膽固醇、甘油三酯、口服葡萄糖、淀粉、蔗糖耐受量的影響，以及對(duì)胰島RIN-m5fβ細(xì)胞的作用等。
　　方法:
　　1.蘋果樹枝原料用5倍量的體積分?jǐn)?shù)為80％乙醇水溶液于90℃回流提取2次，每次30min。
　　采用816型大孔樹脂為柱色譜填料，以水、40％乙醇、60％乙醇、95％乙醇為洗脫溶劑，將蘋果樹枝粗提物分離精制為不同的化學(xué)部分。
　　利用Folin-Ci

3、ocalteu比色法測(cè)定各個(gè)化學(xué)部分的總多酚含量，篩選出多酚含量最高的化學(xué)部分。
　　采用小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病ICR小鼠模型對(duì)篩選出的化學(xué)部分的降血糖活性進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　2.采用多種色譜法如硅膠柱色譜、開放ODS柱色譜、制備型反相HPLC等分離方法對(duì)篩選出的蘋果樹枝多酚類化學(xué)部分進(jìn)行系統(tǒng)分離。通過(guò)共薄層、理化性質(zhì)和EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、COSY等譜學(xué)方法對(duì)分離得到的單體成分

4、的平面結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。
　　3.通過(guò)UV法對(duì)篩選出的蘋果樹枝多酚類化學(xué)部分的質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究。選用簡(jiǎn)便、快速、易行的NaNO2-Al(NO3)3顯色法對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。
　　4.建立多次小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，并隨機(jī)分組，給予蘋果樹枝多酚類成分一周后尾靜脈取血，利用葡萄糖試劑盒、甘油三酯和總膽固醇試劑盒測(cè)定其對(duì)血糖、甘油三酯和總膽固醇的影響。測(cè)定糖尿病小鼠灌服葡萄糖、蔗糖和淀粉0、1及2h血糖

5、值，與模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組比較，確定其對(duì)糖尿病小鼠的糖耐量的影響。
　　另外采MTT法測(cè)定蘋果樹枝多酚類成分對(duì)胰島RIN-m5fβ細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示水部分、40％乙醇部分、60％乙醇部分、95％乙醇部分總多酚含量依次為3774.5μg/g、4320.9μg/g、6918.6μg/g、1305.5μg/g，其中60％乙醇部分總多酚含量最高。另外蘋果樹枝提取物60％乙醇部分在給藥2h后對(duì)小劑量

6、鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有很好的降血糖作用。
　　2.共從蘋果樹枝60％乙醇部分分離并鑒定了8個(gè)多酚類單體化合物，分別為:phloridzin,(1)4-hydroxybenzoic acid,(2) protocatechuic acid methylester,(3) cinnamic acid,(4)6-methoxy quercetin,(5)6-methoxy quercetin-3-O-α-L-rhamno-pyr

7、anoside，(6) phloretin(7) quercetin，(8)其中化合物2、3、5、6為首次從該植物中分離得到。
　　3.本實(shí)驗(yàn)建立的NaNO2-Al(NO3)3顯色法平均回收率為102.78％，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.68％，所用方法簡(jiǎn)便、快速、易行，精密度考察、穩(wěn)定性考察、重現(xiàn)性試驗(yàn)及線性關(guān)系考察均符合要求，可用于蘋果樹枝60％乙醇部分的總黃酮的質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘋果樹枝60％乙醇部分的總黃酮含量高達(dá)15.7

8、8mg/g。NaNO2-Al(NO3)3顯色法的原理是在堿性條件下，絡(luò)合反應(yīng)發(fā)生在黃酮B環(huán)的3'，4'-鄰二酚羥基部位，一些不帶鄰二酚羥基的黃酮類化合物（如根皮苷、根皮素等）不能通過(guò)此方法檢測(cè)到，因此在蘋果樹枝60％乙醇部分中總黃酮的含量可能更高。
　　4.運(yùn)用糖尿病動(dòng)物模型對(duì)蘋果樹枝提取物60％乙醇部分的降血糖功效進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，蘋果樹枝提取物在給藥一段時(shí)間后，對(duì)小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病ICR小鼠有良好的降血糖作

9、用;蘋果樹枝提取物給藥一周后能夠明顯降低小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病ICR小鼠血液中甘油三脂的含量，而且能夠加快小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病ICR小鼠體內(nèi)葡萄糖的代謝，從而增加糖耐受量?？诜咸烟?、蔗糖、淀粉耐量實(shí)驗(yàn)同樣證明了蘋果樹枝提取物具有良好的降血糖作用。蘋果樹枝提取物60％乙醇部分在高劑量時(shí)降血糖作用明顯，低劑量時(shí)無(wú)作用，且口服葡萄糖、蔗糖、淀粉耐量實(shí)驗(yàn)也沒有抑制血糖升高。
　　同時(shí)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蘋果樹枝提取物60％乙