NR2A抑制劑通過調(diào)控AQP4的表達(dá)抑制癲癇發(fā)作的研究.pdf

1、目的：
　　癲癇（Epilepsy, EP）是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。癲癇發(fā)病機制至今仍不明確，這無疑給其治療帶來極大困惑，因此尋找新的靶點治療癲癇仍是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)研究者急需解決的問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，N-甲基-D-天冬氨酸（N-mathy1-D-aspartate, NMDA）受體亞型NR2A抑制劑可下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)，抑制癲癇的發(fā)作；水通道蛋白4（Aquaporin4, AQP4）抑制劑乙酰唑胺，可抑制AQP4的表達(dá)，延

2、緩癲癇的發(fā)作；另有研究證實，NR2A可調(diào)控AQP4的表達(dá)。本研究通過檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus, SE）后不同時間點大鼠海馬組織AQP4的表達(dá)情況和海馬組織水含量的變化，同時在SE后AQP4表達(dá)的最高時間點，檢測NR2A抑制劑對海馬組織AQP4表達(dá)的影響，觀察腦水腫形成情況，從而探討NR2A抑制劑是否通過調(diào)控AQP4的表達(dá)而抑制癲癇的發(fā)作，目的是研究NR2A抑制劑抑制癲癇發(fā)作的作用機制，為尋找新靶點NR2A抑

3、制劑治療癲癇提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　將實驗大鼠隨機分為6組：對照組（腹腔注射生理鹽水）、SE后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h組（腹腔注射戊四氮致癇），通過Western blot、RT-qPCR檢測各組大鼠海馬組織中AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色法檢測大鼠海馬組織中AQP4的表達(dá)和分布，采用干—濕重法檢測大鼠海馬組織中的水含量。通過上述實驗，研究在戊四氮（pentylenetetraz

4、ol, PTZ）誘導(dǎo)的SE模型中AQP4以及海馬組織水含量在72 h內(nèi)的動態(tài)表達(dá)變化，篩選出AQP4表達(dá)的最高時間點，為下一步實驗提供依據(jù)。
　　將32只成年大鼠隨機分成4組：對照組（先側(cè)腦室注射生理鹽水，再腹腔給予生理鹽水）、致癇組（先側(cè)腦室給予等量生理鹽水，再腹腔注射PTZ）、PEAQX處理組（先側(cè)腦室注射PEAQX處理30 min，再腹腔注射PTZ）、PEAQX對照組（先側(cè)腦室注射PEAQX預(yù)處理30 min，再腹腔注射生理

5、鹽水）。在上述檢測的AQP4表達(dá)的最高時間點，觀察每組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，并使用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)記錄各組大鼠腦電的變化，Western blot和RT-qPCR檢測AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，干—濕重法檢測每組大鼠海馬組織中水含量的變化。
　　結(jié)果：
　　Western blot、RT-qPCR結(jié)果：致癇組大鼠海馬組織中AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)從12 h開始增加，24 h達(dá)到高峰與對照組相比明顯升高（P<0.0

6、5），持續(xù)至48 h后降低，至72 h時其含量仍比對照組高（P<0.05）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下可見AQP4主要表達(dá)在海馬組織CA3區(qū)，不同時間點的免疫反應(yīng)強弱不一，對照組及SE0 h組雖然可見陽性物質(zhì)，但顆粒染色淺，分布稀疏， SE12 h組、SE24h組觀察到CA3區(qū)AQP4免疫反應(yīng)逐步增強，陽性著色細(xì)胞數(shù)量逐步增加， SE24 h組達(dá)到高峰，明顯強于對照組（P<0.05），到SE48 h組、SE72h組免疫反應(yīng)逐漸減

7、弱，陽性細(xì)胞數(shù)量減少，但仍高于對照組（P<0.05）；干—濕重法結(jié)果：對照組大鼠腦組織水含量為[（83.067±1.534）％]，SE后12 h組大鼠腦水含量開始增加，至24 h大鼠腦水含量為[（89.967±2.500）％]明顯高于對照組（P<0.05），持續(xù)至48 h后降低，至72 h時大鼠腦中含水量為[（87.833±2.567）％]仍比對照組高（P<0.05）。通過側(cè)腦室注射PEAQX后，行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)對照組、PEAQX對照組無

8、癇性發(fā)作，致癇組癲癇發(fā)作明顯且迅速，PEAQX干預(yù)組明顯延長了PTZ致癲癇的潛伏期，降低了癲癇發(fā)作級別；腦電圖結(jié)果：對照組、PEAQX對照組沒有明顯癲癇波，致癇組記錄到多個棘波或棘—慢綜合波等癲癇波，PEAQX干預(yù)組癲癇波減少；Western blot、RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)致癇組AQP4蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加，與對照組相比差異顯著（ P<0.05）， PEAQX干預(yù)組與致癇組比較發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)降低（P<0.05），但仍高于對照組