耐藥蛋白抑制劑維拉帕米治療難治性癲癇的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 癲癇是神經(jīng)內(nèi)科常見的疾病，是由于一側(cè)或兩側(cè)大腦半球神經(jīng)元異常同步放電引起的短暫性腦功能障礙，盡管不斷有新的抗癲癇藥(antiepileptic drugs，AEDs)投入臨床應(yīng)用，但仍有大約20％-30％的患者發(fā)展為難治性癲癇(refractory epilepsy，RE)。目前有關(guān)難治性癲癇耐藥性的機(jī)制尚不十分清楚。有研究顯示血腦屏障(blood—brain barrier，BBB)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上存在多種藥物外向

2、轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)成BBB的另一道屏障，與癲癇的多藥耐藥性相關(guān)。多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體是一些能與藥物結(jié)合并能將其轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的蛋白，包括三磷酸腺苷結(jié)合盒(ABC)超家族成員如磷酸糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白、乳腺癌抗藥蛋白、大腦多藥抗藥蛋白和Ras超家族成員RL—IP76。生理?xiàng)l件下多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體作為外排泵，能夠主動將藥物泵出到血腦屏障以外，從而保護(hù)腦實(shí)質(zhì)。因此多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和腦組織內(nèi)藥物濃度降低成正比[10]，

3、P—gp是首先被發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥蛋白質(zhì)，它由多藥耐藥基因(multidrug resistant gene，MDR)編碼，病理情況下如癲癇發(fā)作的強(qiáng)度、時(shí)程、長期服用抗癲癇藥等都可以使P—gp表達(dá)上調(diào)，限制癲癇藥物進(jìn)入腦組織，使患者腦內(nèi)抗癲癇藥物濃度下降，這可能參與了難治性癲癇多藥耐藥的發(fā)生。因而改善耐藥性癲癇預(yù)后的方法就是針對耐藥性癲癇P—gp的過度表達(dá)，避免P—gp的外排作用、加強(qiáng)抗癲癇藥物的作用。目前有許多抑制P—gp的藥物逐漸被證實(shí)

4、，包括鈣通道阻滯劑、激素、蛋白激酶C抑制劑、免疫抑制劑、抗生素、表面活性劑等。但是這些研究多集中在對P—gp功能的影響，鑒于此，本課題擬建立慢性癲癇模型，給予P—gp抑制劑聯(lián)合常規(guī)抗癲癇藥物，研究P—gp抑制劑對難治性癲癇腦組織P—gp表達(dá)的影響，探討P—gp抑制劑的價(jià)值，為臨床難治性癲癇的治療提供新的方向。 目的：建立氯化鋰—匹羅卡品慢性癲癇模型，觀察P—gp抑制劑維拉帕米對難治性癲癇大鼠的腦電圖、自發(fā)性癲癇的發(fā)作頻率和程度、

5、大腦皮層及海馬組織P—gp表達(dá)的影響。 方法(1)建立氯化鋰—匹羅卡品慢性癲癇模型：雄性wistar大鼠50只，安裝大腦皮層電極，兩周之后，給予氯化鋰—匹羅卡品，誘發(fā)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)，終止發(fā)作后存活且狀態(tài)良好的大鼠出現(xiàn)自發(fā)性癲癇視為造模成功。(2)將造模成功的大鼠，經(jīng)過耐藥性選擇后，分為生理鹽水組、匹羅卡品組、卡馬西平組、低劑量維拉帕米組、高劑量維拉帕米五個(gè)組。分別給予相應(yīng)的藥物，觀察各組大鼠自發(fā)性癲癇的發(fā)作次數(shù)與發(fā)作級別，并記

6、錄各組大鼠在不同時(shí)期的腦電圖，取包括海馬在內(nèi)的腦塊，通過免疫組化染色，圖像分析各組P—gp表達(dá)陽性面積率，半定量測定大鼠海馬組織及皮層P—gp的表達(dá)程度。 結(jié)果： (1)造模過程中，除生理鹽水組的6只大鼠之外，其余44只大鼠均誘發(fā)出癲癇持續(xù)狀態(tài)，存活且狀態(tài)良好者38只，出現(xiàn)自發(fā)性癲癇者32只。造模成功率為72.73％，行為學(xué)上表現(xiàn)為：出現(xiàn)以口咽自動癥為主的復(fù)雜部分發(fā)作，發(fā)展為強(qiáng)直陣攣發(fā)作，癲癇持續(xù)狀態(tài)一小時(shí)后給與安定中止

7、發(fā)作；兩天后進(jìn)入靜止期，兩周左右發(fā)展為反復(fù)自發(fā)發(fā)作。 (2)慢性期卡馬西平組大鼠的自發(fā)性癲癇發(fā)作次數(shù)發(fā)作程度與匹羅卡品組比較無明顯差別(P＞0.05)，兩個(gè)維拉帕米組與前兩組比較大鼠的發(fā)作頻率明顯減少(P＜0.05)，發(fā)作程度明顯減輕(P＜0.05)。兩個(gè)維拉帕米劑量組之間比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。腦電圖示：匹羅卡品組、卡馬西平組出現(xiàn)陣發(fā)的多棘波，后者較前者波幅壓低，維拉帕米組散在出現(xiàn)單個(gè)棘波或尖波，且波幅明顯降低

8、。 (3)P—gp的表達(dá)結(jié)果：海馬P—gp的表達(dá)較皮層多(P＜0.05)，各組之間比較：與生理鹽水組相比，其他四組的P—gp的表達(dá)均增強(qiáng)，且四組之間陽性面積率從高到低依次是且卡馬西平組、模型組、兩個(gè)維拉帕米組，它們之間均有明顯差異(P＜0.05)，而維拉帕米兩個(gè)劑量組之間無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： (1)本實(shí)驗(yàn)建立的匹羅卡品癲癇模型復(fù)制了人類顳葉癲癇復(fù)雜部分發(fā)作基本特征，是進(jìn)行難治性癲癇研究的一個(gè)較為理