VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性作用于維生素K1及對(duì)華法林對(duì)映異構(gòu)體濃度和藥效學(xué)指標(biāo)影響的研究.pdf

1、目的：華法林（Warfarin，WF）是目前應(yīng)用廣泛的口服抗凝血藥，由于WF的有效治療范圍狹窄，個(gè)體間劑量差異大，有效劑量不易控制，故臨床主要以凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率(international normalized ratio，INR)作為其抗凝監(jiān)測(cè)指標(biāo)。WF用藥劑量受很多因素的影響，包括：維生素K的攝入、種族、年齡、合并用藥、體重指數(shù)以及遺傳基因等方面的因素。本研究通過(guò)分析遺傳基因（V

2、KORC1和CYP4F2）和維生素K1（VitaminK1，VK1）對(duì)WF的劑量反應(yīng)的作用、血漿中VK1濃度和CYP4F2基因多態(tài)性以及與VKORC1的相關(guān)性，嘗試揭示體內(nèi)VK1的濃度與WF敏感指數(shù)的關(guān)系，為今后WF在臨床上的個(gè)體化給藥提供參考，以期達(dá)到提高抗凝控制率、減少出血風(fēng)險(xiǎn)、增強(qiáng)臨床醫(yī)生使用WF治療信心的目的。
　　方法：血漿VK1的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法：采用APCI源正離子模式，穩(wěn)定性同位素標(biāo)記物(Vitamin

3、K1-d7)為內(nèi)標(biāo)定量， VK1和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)質(zhì)荷比分別為m/z：451.0→187.0和458.6→194.4，乙醇沉淀蛋白，環(huán)己烷為萃取劑進(jìn)行液液萃取，使用Synergl4u Fusion-RP C18（2.1mm×100mm，2.5μm）進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為A：B=水（0.05％甲酸）：甲醇，梯度洗脫程序，流速0.3mL/min；血漿WF對(duì)映異構(gòu)體的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法：采用ESI源負(fù)離子模式，萘普生為內(nèi)標(biāo)定量，WF

4、和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)質(zhì)荷比分別為m/z：307.2→160.9和228.9→185.1，1mol/L鹽酸作為緩沖環(huán)境，乙酸乙酯液液萃取。通過(guò)Lux Cellulose-3手性色譜柱（2.1mm×100mm，2μm）分離WF對(duì)映異構(gòu)體和內(nèi)標(biāo)，A：B=水(0.5%甲酸)：甲醇，流速：0.2mL/min；臨床樣本的收集、采集以及檢測(cè)：收集南京東南大學(xué)附屬醫(yī)院正常使用WF達(dá)到穩(wěn)定劑量的房顫患者21例作為觀察組，選擇同期健康受試者55例作為對(duì)照組，

5、統(tǒng)一給予實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)餐?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①患者穩(wěn)定抗凝至少3個(gè)月（抗凝水平在治療窗以內(nèi)）；②抽血前一個(gè)月有穩(wěn)定的日常WF劑量。排除標(biāo)準(zhǔn)：有和胺碘酮以及抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用的。WF抗凝治療方案：初始劑量1~3mg，根據(jù)INR調(diào)整劑量。觀察組實(shí)驗(yàn)清晨空腹抽取WF給藥前谷濃度外周血9.0mL，對(duì)照組空腹抽取外周血5.0mL。分別檢測(cè)每位患者血漿中VK1以及WF對(duì)映異構(gòu)體濃度、凝血因子水平、PT/INR、VKORC1、CYP4F2、CYP2C9基因型；檢測(cè)

6、每位健康受試者血漿中VK1和 VKORC1、CYP4F2基因型。根據(jù)所測(cè)得VK1和WF對(duì)映異構(gòu)體濃度，結(jié)合VKORC1和CYP4F2基因型和凝血因子水平、PT-INR，采用Origin統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)基因多態(tài)性和VK1與WF對(duì)映異構(gòu)體濃度和藥效學(xué)指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：研究建立的檢測(cè)血漿中VK1和WF對(duì)映異構(gòu)體濃度的HPLC-MS/MS測(cè)定方法通過(guò)方法學(xué)考察，證明準(zhǔn)確、可靠。由于樣品量有限和WF個(gè)體差異大等因素，研究中雖未發(fā)現(xiàn)

7、患者血漿中VK1濃度和WF敏感指數(shù)顯著性相關(guān)，但在中國(guó)部分漢族人群中證明了VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性顯著地影響血漿中VK1濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶VKORC1G/A基因型的患者VK1濃度顯著性的高于攜帶A/A基因型的患者（p<0.05）；攜帶CYP4F2C/T和T/T基因型的患者VK1濃度顯著性的高于攜帶C/C基因型的患者（p<0.05）。而健康受試者中，VKORC1基因多態(tài)性和VK1的濃度的相關(guān)性不顯著，但CYP4F2（T/T

8、+C/T）基因型的VK1濃度顯著高于C/C基因型（p<0.05）。結(jié)合文獻(xiàn)提示臨床醫(yī)生在 WF的治療過(guò)程中，攜帶VKORC1G/G+CYP4F2T/T基因型的患者有較寬的WF治療窗，相對(duì)安全；攜帶VKORC1G/A+CYP4F2C/T基因型的患者使用WF時(shí)要監(jiān)測(cè)INR，不斷調(diào)整WF個(gè)體用藥，以達(dá)到安全用藥的目的；值得注意的是攜帶VKORC1A/A+CYP4F2C/C基因型的患者對(duì)WF劑量特別敏感，臨床中不僅要實(shí)時(shí)檢測(cè)INR；還需要通過(guò)調(diào)

9、整飲食，嚴(yán)格控制VK1的攝入量；必要時(shí)換用新型口服抗凝藥保證患者的用藥安全。
　　結(jié)論：建立的HPLC-MS/MS測(cè)定血漿中VK1和WF對(duì)映異構(gòu)體濃度的方法已成功運(yùn)用到檢測(cè)房顫患者的VK1和WF對(duì)映異構(gòu)體濃度的臨床試驗(yàn)中，且方法簡(jiǎn)單易行，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。在中國(guó)漢族人群中首次證明了VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性顯著地影響血漿中VK1濃度。本研究結(jié)果建議在使用WF時(shí)要注意VKORC1和CYP4F2基因多態(tài)性、維生素K1水