AML1-ETO9a的產生機制及惡性血液病侵襲性真菌病的二級預防.pdf

1、第一章在t(8;21)AML中選擇性剪切體AML1-ETO9a產生的調控機制
　　目的:染色體易位是急性髓系白血病(AML)最常見的細胞遺傳學異常。t(8;21)(q22;q22)是AML中最常見的染色體易位，易位形成的AML1-ETO融合基因是t(8;21)AML的顯著特征和始發(fā)因素，同時，存在其他的事件協(xié)同引起AML的發(fā)生。研究證實，AML1-ETO的選擇性剪切體AML1-ETO9a與此類白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關，但A

2、ML1-ETO9a產生的調控機制目前尚不清楚。
　　材料與方法:
　　1、收集21例AML1-ETO陽性配對樣本（同一患者不同病程的樣本，包含初治或者復發(fā)的樣本以及緩解的樣本），2例AML1-ETO陰性（也屬于AML-M2患者）配對樣本，進行外顯子高通量測序分析體細胞突變數(shù);對23例樣本的突變基因重現(xiàn)性分析;
　　2、從大量AML臨床樣本和正常人骨髓表達芯片數(shù)據(jù)庫中，分析不同染色體核型樣本中，富含絲氨酸/精氨酸剪接因子

3、(SRSF)總體上的表達水平;分析22例AML1-ETO陽性、22例AML1-ETO陰性和5例正常人骨髓中表達芯片數(shù)據(jù)庫，找出在AML1-ETO陽性樣本中異常高表達的剪切因子SRSF2、SRSF6和SRSF11;克隆ETO9a外顯子及其側翼序列，體外轉錄，RNA沉淀(RIP)，質譜分析，對所得到的145個差異且有意義的蛋白進行信號途徑分析;Western blot對RIP及質譜結果進行驗證;
　　3、構建SRSF2的慢病毒表達載體

4、，轉染細胞株，克隆形成實驗及細胞增殖實驗，證實SRSF2對選擇性剪切體AML1-ETO9a產生的影響，以及對AML1-ETO陽性和陰性的細胞增殖及惡性表型的影響;
　　4、生物信息學分析及熒光素酶驗證AML1-ETO9a是miR-9-1的靶基因;熒光定量PCR檢測miR-9-1在細胞系和臨床樣本中的表達。
　　結果:
　　1、外顯子高通量測序結果表明:23例樣本，每個初治或者復發(fā)樣本的體細胞平均突變位點數(shù)目為18.6個

5、，突變基因重現(xiàn)性統(tǒng)計，分析可能存在的共性基因突變，其中重現(xiàn)性最高的基因是c-KIT，其重現(xiàn)性為17.4％(4/23)，其次為NRAS占13％(3/23)，F(xiàn)LT3、NOTCH1、PHF6各占8.7％(2/23)?？偨Y蘇州大學和我們的臨床樣本分析數(shù)據(jù)以及美國UCSD張東爾教授的結果發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO9a在AML1-ETO陽性的臨床樣本中所占得比例分別為100％(44/44)、100％(10/10)和95％(35/37)，均遠高于c-K

6、IT突變。
　　2、在t(8;21)AML中，SRSF總體上的表達明顯比其它各型染色體異常AML臨床樣本中高，進一步研究發(fā)現(xiàn)，SRSF2、SRSF6、SRSF11這三個剪切因子在AML1-ETO陽性的AML中異常高表達。
　　3、用ETO9a外顯子及其側翼序列進行的RIP及質譜分析，對有差異的145個有意義的蛋白進行信號途徑分析發(fā)現(xiàn)，超過82％(119/145)的蛋白與核mRNA的剪切、加工、剪切復合體的裝配、調控密切相關，

7、其它的18％(26/145)蛋白則負責調控細胞的凋亡和死亡。SRSF2的慢病毒轉染AML1-ETO陽性的細胞株Kasumi-1和SKNO-1，定量PCR檢測AML1-ETO和AML1-ETO9a的表達，發(fā)現(xiàn)在這兩種細胞系中AML1-ETO9a的表達量顯著提高，分別從13％和7.5％提高到54.2％和50.6％,證實SRSF2可以導致AML1-ETO9a選擇性剪切體的產生，克隆形成實驗及細胞增殖實驗證實，SRSF2可特異性地調控AML1-

8、ETO融合基因陽性細胞的惡性增殖，而對AML1-ETO陰性的細胞系如HL-60則沒有影響。
　　4、生物信息學分析、熒光素酶報道載體及Western blot證實，AML1、AML1-ETO、AML1-ETO9a都是miR-9-1的靶基因，而實時熒光定量PCR證實miR-9-1在t(8;21)AML表達明顯降低。
　　結論:
　　1、從遺傳學、基因結構、基因功能及重現(xiàn)性上來說，AML1-ETO9a是t(8;21)AML

9、一個更為普遍的“第二次打擊”;
　　2、在轉錄/剪切水平上，剪切因子SRSF2促進了AML1-ETO9a的選擇性剪切，并且特異性地促進了AML1-ETO陽性細胞的惡性增殖;
　　3、翻譯水平上，AML1-ETO9a是miR-9-1的一個靶基因，miR-9-1可以抑制AML1-ETO9a的蛋白翻譯，而miR-9-1在t(8;21) AML中表達明顯降低，從而導致AML1-ETO9a大量翻譯出蛋白，導致t(8;21)AML的發(fā)生

10、。
　　第二章惡性血液病患者中侵襲性真菌病的二級預防
　　目的:侵襲性真菌病(IFD)在惡性血液病患者中發(fā)病率和死亡率均很高，有IFD病史的患者在進一步的化療或造血干細胞移植(HSCT)中，IFD復燃率高，預后差。二級預防(SAP)可有效地預防IFD復燃。本研究旨在探討有IFD病史的惡性血液病患者接受進一步的化療或HSCT時進行SAP的策略和療效，分析SAP失敗的危險因素。
　　材料與方法:回顧性分析了2008年1月至

11、2013年6月就診于該院血液科接受化療或HSCT且既往有IFD病史的惡性血液病患者的病歷資料，分析患者的臨床特點和IFD的診斷標準，探討不同SAP策略的療效以及影響IFD復燃的危險因素。
　　結果:入組164例患者，中位隨訪180天，40例出現(xiàn)IFD復燃，其中121例(73.78％，121/164)進行SAP的患者復燃20例，復燃率為16.5％(20/121),43例未進行SAP的患者復燃20例，復燃率為46.5％(20/43)，

12、兩組復燃率比較有顯著性差異。121例進行SAP的患者，其中58例選用既往抗真菌治療有效的藥物進行SAP，8例IFD復燃，復燃率13.8％(8/58),63例換用其他廣譜抗真菌藥物進行SAP，12例IFD復燃，復燃率19.0％(12/63)，兩組復燃率比較無顯著性差異。異基因HSCT患者IFD復燃率(25％，15/60)明顯高于化療或自體HSCT患者(8.2％，5/61)。多因素分析二級預防下IFD復燃的危險因素顯示異基因HSCT為影響I