犬頸動脈分叉部動脈瘤發(fā)生模型的建立及其形態(tài)學(xué)、血流動力學(xué)和組織病理學(xué)研究.pdf

1、第一部分頸動脈分叉部動脈瘤模型的建立
　　目的：探討血流動力增加聯(lián)合彈力蛋白酶消化血管壁內(nèi)彈力板和中膜結(jié)構(gòu)，建立犬動脈分叉頂端實驗性動脈瘤的可行性。
　　方法：（1）通過在體試驗測試不同濃度彈力蛋白酶、在不同孵化時間下對血管壁結(jié)構(gòu)破壞程度，選擇構(gòu)建頸動脈彈力板和中膜破壞最佳彈力蛋白酶濃度和孵化時間；（2）實驗犬18只，手術(shù)重建犬頸總動脈構(gòu)建Y-型動脈分叉，9只Y-型分叉分叉頂端采用彈力蛋白酶孵化，9只Y-型分叉頂端給予生理鹽

2、水假處理。術(shù)后1周、4周、3月行TCD和多普勒以及頸動脈血管造影觀察Y-型分叉頂端是否伴有動脈瘤形成或動脈瘤樣結(jié)構(gòu)早期變化。術(shù)后3月獲取Y-型分叉頂端組織學(xué)標本行病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果:(1)濃度為3.0 U/μl的彈力蛋白酶溶液持續(xù)孵化頸總動脈血管壁能夠有效破壞內(nèi)彈力板和中膜。(2)實驗組和對照組Y-型分叉近端供養(yǎng)動脈血流速度術(shù)前、術(shù)后無明顯差異，術(shù)后1周、3月所有實驗動物Y-型分叉近端供養(yǎng)動脈血流速度均較術(shù)前明顯增加。9只經(jīng)彈

3、力蛋白酶處理的Y-型分叉頂端實驗動脈，隨訪血管造影和組織學(xué)觀察5只可見頂端囊狀動脈瘤形成，形態(tài)為寬基底型，瘤體平均直徑3.2±0.4 mm，瘤頸6.7±2.3 mm；未經(jīng)彈力蛋白酶處理的Y-型分叉頂端實驗動脈，隨訪血管造影均未見囊狀動脈瘤形成。組織學(xué)觀察顯示實驗組和對照組分叉頂端均可見新生內(nèi)膜墊形成，實驗組鄰近新生內(nèi)膜墊附近可見典型動脈瘤病理結(jié)構(gòu)，而對照組鄰近新生內(nèi)膜墊附近可見動脈瘤樣血管壁重塑。
　　結(jié)論：血流動力增加聯(lián)合彈力蛋

4、白酶消化血管壁內(nèi)彈力板和中膜結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)犬動脈分叉頂端實驗性動脈瘤。該犬模型可以用來進一步研究血流動力學(xué)、基因、蛋白或生理通道等對動脈瘤發(fā)生、發(fā)展、破裂的作用。
　　第二部分頸動脈分叉部動脈瘤模型的組織病理學(xué)研究
　　目的：在犬分叉部血管動物模型建立的基礎(chǔ)上，研究動脈壁退化、炎癥和細胞免疫反應(yīng)是否會導(dǎo)致動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　方法：建立18只犬頸總動脈（CCA）新的動脈分叉模型，隨機分組為彈力蛋白酶處理動脈組（EBG，

5、n=9）和分叉模型對照組（CBG,n=9）。同時用彈力蛋白酶處理直段 CCA作為直段對照組（ESG,n=3）。分別在術(shù)后12周（n=6）和24周(n=3)取EBG和CBG重建血管分叉的樣本，ESG（n=3）在術(shù)后24周取雙側(cè)頸動脈直血管樣本。術(shù)后獲得的CCA樣本行HE染色、Masson染色和彈力纖維染色。連續(xù)切片來評估重建血管分叉部組織學(xué)改變用Envision技術(shù)以抗小鼠增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、小鼠α單克隆平滑肌肌動蛋白抗體、小

6、鼠抗巨噬細胞單克隆抗體(MAC387)、MMP-2和MMP-9單克隆抗體為CCA樣本行免疫標記。采用抗CD45的白細胞抗體和抗 MAC387的抗巨噬細胞抗體行免疫雙熒光染色，判斷白細胞中是包含否有巨噬細胞。測量平滑肌細胞增殖率（PCNA陽性平滑肌細胞所占比例）、彈力層和肌動蛋白陽性平滑肌層厚。炎癥細胞浸潤指數(shù)為CD45陽性細胞在血管分叉中膜有核細胞所占百分比。MMP-2和MMP-9表達水平定義為MMP-2/9陽性區(qū)域在血管分叉中膜中所占

7、的面積百分比。組織病理學(xué)圖像的統(tǒng)計分析軟件為Image-Pro Plus Version6.0版(Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA)，每個切片的中至少隨機選擇20個以上的高倍鏡視野（×400倍）進行分析。
　　用軟件GraphPad Prism5.0(San Diego, CA, USA)進行統(tǒng)計分析。連續(xù)變量用平均值±標準差表示，數(shù)值變量以數(shù)量或百分比表示。用確切概率法(Fis

8、her’s檢驗)來比較分類資料。組間t檢驗來比較平滑肌細胞增殖率、彈力層和肌動蛋白陽性平滑肌層厚、炎癥細胞浸潤程度、MMP-2和MMP-9表達水平。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:在形成動脈瘤的5個血管分叉樣本中，活體組織觀察發(fā)現(xiàn)整個血管壁變薄，成為半透明狀態(tài)，并能觀察到內(nèi)部血流，從而容易導(dǎo)致變薄的血管壁膨出，分叉部動脈瘤形成。
　　HE染色、Masson染色顯示ESG和EBG分叉部中膜變薄

9、，平滑肌細胞減少，纖維連接缺失。彈力纖維染色顯示ESG和EBG中，內(nèi)彈力板不連續(xù)，彈力纖維斷裂；CBG中三只動物動脈分叉頂部出現(xiàn)內(nèi)膜輕度損傷。彈力蛋白酶的作用降低了中膜彈力纖維層厚，在EBG為21.2±15.3μm，ESG為71.28±19.47μm，而 CBG中為119.4±29.9μm（P<0.001）。
　　免疫組化染色顯示，EBS中彈力蛋白酶處理過的動脈分叉頂部血管壁SMA陽性的平滑肌細胞數(shù)量減少，PCNA陽性的平滑肌細胞

10、數(shù)目比例明顯增加，EBG中為42.0±15.7％（對比ESG中為7.3±3.8%,CBG中為8.0±6.3%;P<0.001），平滑肌層變薄，在EBG中為31.3±16.7μm(對比 ESG中136.5±25.5μm,CBG中133.9±26.1μm, P<0.001)。血管壁炎癥細胞浸潤程度EBG中為38.4±10.6%(對比 ESG中5.1±2.1%, CBG中2.9±2.4%;P<0.001)。巨噬細胞染色顯示血管壁內(nèi)有巨噬細胞浸

11、潤，分布和白細胞相似。動脈瘤壁MMP-2和MMP-9表達水平分別為21.0±8.7%(對比ESG中1.2±1.4%，CBG中0.8±1.2%;P<0.001)和13.6±5.6%(對比ESG中0.9±0.8%，CBG中0.4±0.6%;P<0.001)。
　　結(jié)論：經(jīng)過24周隨訪，EBG中5/9成功誘發(fā)動脈瘤，均經(jīng)血管造影及病理確認。組織學(xué)分析顯示EBG內(nèi)彈力板（IEL）不連續(xù)、彈力纖維斷裂、肌層變薄、平滑肌細胞減少、炎性細胞浸潤

12、（巨噬細胞）以及MMP-2和 MMP-9表達增多（對比CBG和ESG，P<0.001）。根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)推測動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展和血管壁結(jié)構(gòu)退行性變相關(guān)，炎癥免疫反應(yīng)在動脈瘤形成、生長中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。
　　第三部分頸動脈分叉部動脈瘤模型的形態(tài)學(xué)、血流動力學(xué)研究
　　目的：在犬分叉部血管動物模型建立的基礎(chǔ)上，研究特定血流動力學(xué)變化、形態(tài)學(xué)變化是否會導(dǎo)致動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　方法：建立18只犬頸總動脈（CCA）

13、新的動脈分叉模型，隨機分組為彈力蛋白酶處理動脈組（EBG，n=9）和分叉模型對照組（CBG,n=9）。同時用彈力蛋白酶處理直段CCA作為直段對照組（ESG,n=3）。在術(shù)后即刻、術(shù)后12周、術(shù)后24周分別行血管造影和計算機流體動力學(xué)（CFD）分析，如果動脈瘤樣囊泡形成，從3D-DSA圖像上分別測量瘤頸和瘤體最大值、載瘤動脈直徑和角度。用3D-DSA行旋轉(zhuǎn)性血管造影(Syngo AXIOM-Artis, Siemens, Germany)

14、對重建血管分叉部進行三維成像，并測血管分叉血流流速作為邊界條件引入 CFD模擬軟件(Mimics10.0; Materialise, Leuven, Belgium)，分析壁切應(yīng)力（橫向力WSS），流速場，流速曲線，表面相對壓力場（縱向力）和總壓力場。計算壁切應(yīng)力梯度（WSSG），同時對EBG血管分叉模型的WSS和WSSG進行定量分析。
　　結(jié)果:血管分叉模型在所有動物均成功建立。血管造影顯示EBG組9只犬模型中的5只可以在動脈分

15、叉頂部觀察到新生動脈瘤形成。但EBG隨訪24周后未觀察到動脈瘤破裂，較12周隨訪時僅有輕度增大（3.5±0.3 mm對比3.0±0.2 mm;P=0.076）。載瘤動脈直徑和成角分別為在CBG為4.3±0.4 mm和112.9±36.1°，在EBG為4.3±0.4 mm和120.3±44.2°。EBG中形成動脈瘤模型的5根載瘤動脈分叉角度為146.8±40.84°，而對照組為87.25±18.87°（P=0.032）。
　　CFD

16、分析顯示：由于對側(cè)CCA的結(jié)扎，重建血管分叉中載瘤動脈內(nèi)血流速度從85.3±7.5 cm/s增長至128.8±13.1 cm/s。術(shù)后CBG和EBG載瘤動脈壁WSS增高，血管分叉根部區(qū)域處于一個更為復(fù)雜的血流動力學(xué)環(huán)境中。血管分叉頂部 WSS減低、血流速度減慢，沿分叉頂部往兩側(cè)，WSS和血流速度都是先增大至最大值而后下降至和直段動脈相近。分叉頂部的相對壓力和總壓力最高，然后再向血管分支方向減低至正常值。血流動力學(xué)參數(shù)在術(shù)后和24周后在E

17、SG、CBG和EBG中4/9沒有出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變的模型中是相似的。EBG中5/9產(chǎn)生動脈瘤的血管的WSS和WSSG進行定量分析，分別在動脈分叉頂部同側(cè)相距1、2、3mm處進行，顯示術(shù)后24周發(fā)生明顯下降(P≤0.01)，這導(dǎo)致囊狀動脈瘤的形成。這些動物隨訪過程中相對壓力和總壓力也是降低的。對EBG術(shù)后WSS和WSSG的定量分析顯示動脈瘤形成的模型較無動脈瘤形成的模型WSS（多在頂部2mm處）和WSSG（頂部0-2mm處）通常更高。

18、　　結(jié)論：本實驗雖然對所有模型都進行了彈力纖維的損傷來模擬動脈壁退化，但只有在5/9模型中出現(xiàn)了新生動脈瘤。我們認為血管分叉角度是重要的影響因素，“T”型分叉（146.8±40.84°）比“Y”型分叉（87.25±18.87°）更易發(fā)生動脈瘤。分叉角度與血流速度和渦流強度緊密相關(guān)，角度越大，分叉頂部周圍渦流強度越大，層流紊亂，從而產(chǎn)生各種機械刺激，如 WSS和 WSSG。本實驗對血管分叉部 WSS和WSSG的定量分析證明較大血管分叉模型