未羧化骨鈣素對氟致糖代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本文研究了未羧化骨鈣素對氟致糖代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。本研究分為三個部分：
　　第一部：分過量氟對機(jī)體內(nèi)骨鈣素含量與糖代謝的影響。
　　目的：探討不同劑量氟作用于機(jī)體后對骨鈣素及糖代謝的影響。
　　方法：⑴選取確診為氟骨癥的65例患者為氟骨癥組，診斷無骨病變且排除相關(guān)骨骼疾病的其他65例病人作對照組。記錄一般情況，計算體質(zhì)指數(shù)(Body Mass Index,BMI)，酶聯(lián)免疫吸附實驗法(Enzyme linked imm

2、unosorbent assay,ELISA)測定血清總骨鈣素(total Osteocalcin,tOCN)、未羧化骨鈣素(uncarboxylated Osteocalcin,ucOCN)、空腹胰島素(Fasting Insulin,FINS)含量，化學(xué)法測定血糖(Glucose,GLU)、糖化血清蛋白(Glycated serum protein,GSP)含量，計算胰島素抵抗指數(shù)(Insulin resistence index,

3、HOMA-IR)。⑵18-24g的C57雄性小鼠36只分為3組，0mg/L、100 mg/L、150 mg/LNaF干預(yù)，2、4、6、8、10、12 W后檢測體質(zhì)量。12W后化學(xué)發(fā)光法檢測血糖、糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin,HbA1c)含量，ELISA法檢測tOCN、ucOCN、FINS、胰高血糖素(Glucagon)含量。蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染

4、色觀察胰腺病理學(xué)變化，免疫組化檢測胰腺骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、周期蛋白D2(CyclinD2)的表達(dá)。
　　結(jié)果：①氟骨癥組與對照組比較 ucOCN、FINS、GSP明顯增高(P<0.05)。氟骨癥組tOCN、HOMA-IR高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。氟骨癥組GLU低于對照組無統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)回歸分析顯示 ucOCN與 FINS呈正相關(guān)(P<0.05)。ucOCN與GLU、HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)(

5、P<0.05)，ucOCN與BMI、tOCN、GSP無相關(guān)性(P>0.05)。②各染氟組間tOCN、ucOCN含量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.31、17.41，P均<0.05)。其中各染氟組小鼠tOCN、ucOCN均高于對照組。組間GLU比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.75,P均＜0.05)，其中各染氟組小鼠GLU均高于對照組。組間HbA1c、Glucagon、FINS含量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=102.40、73.61、5

6、.32， P均<0.05)，其中各染氟組HbA1c、FINS均高于對照組。各染氟組Glucagon含量均低于對照組。ucOCN與tOCN、FINS呈正相關(guān)，與GLU、HbA1c呈負(fù)相關(guān)，與Glucagon無相關(guān)性；150 mg/L染氟組腺泡細(xì)胞形狀偶見不規(guī)則，少量細(xì)胞界限稍模糊，部分胰島細(xì)胞細(xì)胞核變少，分布較稀疏；染氟組小鼠胰腺中OCN表達(dá)呈陰性，CylinD2的表達(dá)呈陽性。
　　結(jié)論：⑴過量氟可導(dǎo)致氟骨癥患者與小鼠血清ucOCN

7、顯著升高，表現(xiàn)為骨組織增殖的骨相損傷。⑵過量氟可導(dǎo)致氟骨癥患者與小鼠糖代謝紊亂，表現(xiàn)為糖代謝異常的非骨相損傷。⑶過量氟作用時，ucOCN與FINS有相關(guān)性。
　　第二部分：不同劑量氟對體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞功能的影響。
　　目的：觀察不同劑量氟化鈉(NaF)對體外培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞增殖活力和胰島素(Insulin, INS)分泌的影響。
　　方法：0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/LNa

8、F分別干預(yù)小鼠胰島Beta-TC-6細(xì)胞24 h、48 h、72 h、96 h后，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，噻唑藍(lán)(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-TetrazoliumBromide,MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖活力；ELISA法測定胰島素分泌變化。
　　結(jié)果：0.5 mg/L、1.0 mg/LNaF作用72 h時，可使胰島β細(xì)胞增殖活力和胰島素分泌較對照組明顯增強(qiáng)(P?0.05)

9、；≥8.0 mg/L時隨著NaF劑量的增加和作用時間的延長，細(xì)胞增殖活力和胰島素分泌明顯減弱(P＜0.05)，且細(xì)胞生長逐漸緩慢，數(shù)量減少，不易貼壁或融合成片，多呈橢圓或圓形細(xì)胞。
　　結(jié)論：低劑量NaF促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和胰島素分泌，隨著劑量增大和時間延長，過量NaF對細(xì)胞增殖活力和胰島素分泌能力的抑制逐漸增強(qiáng)，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　第三部分：ucOCN-GPRC6A通路阻斷后過量氟對體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞功能的影響。

10、　　目的：阻斷(未羧化骨鈣素-G蛋白耦聯(lián)受體 C家族6組成員 A,uncarboxylated Osteocalcin-G protein coupled receptor familyC,Group6,subtype A, ucOCN-GPRC6A)通路后，觀察過量氟對體外培養(yǎng)小鼠胰島 Beta-TC-6細(xì)胞 INS分泌、增殖能力的影響，探討氟是否通過 ucOCN-GPRC6A通路影響小鼠胰島β細(xì)胞功能。
　　方法：選取ucOC

11、N-GPRC6A通路阻斷和未阻斷兩組小鼠胰島Beta-TC-6細(xì)胞，8 mg/LNaF、150 mmol/LucOCN、8 mg/L NaF+150mmol/LucOCN分別干預(yù)48 h，ELISA法測INS含量，提取總RNA、蛋白，RT-PCR、Western blot法檢測CyclinD1、CyclinD2表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴非轉(zhuǎn)染：INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表達(dá)NaF組較空白組顯著降低

12、(P?0.05)，ucOCN組INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表達(dá)較空白組升高， NaF+ucOCN組INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表達(dá)較空白組、ucOCN組降低，較NaF組升高。⑵轉(zhuǎn)染：ucOCN組INS分泌水平、CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表達(dá)較空白無顯著差異。NaF+ucOCN組INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋

13、白的表達(dá)較空白組降低(P0.05)，較NaF染毒組無統(tǒng)計學(xué)意義。⑶兩組間比較：非轉(zhuǎn)染 ucOCN組較轉(zhuǎn)染 ucOCN組 INS分泌水平， CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表達(dá)顯著升高(P0.05)；非轉(zhuǎn)染NaF+ucOCN組較轉(zhuǎn)染NaF+ucOCN組INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表達(dá)顯著升高(P0.05)；非轉(zhuǎn)染空白組、NaF染毒組與轉(zhuǎn)染空白組、NaF染毒組INS分泌水平，Cycli