胰島素對(duì)燒傷早期內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的正性調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　多器官功能障礙綜合癥（MODS）是引起嚴(yán)重?zé)齻颊咚劳龅闹饕蛑弧ｋm然引起MODS的病理生理過(guò)程紛繁復(fù)雜，但隨著研究的深入人們逐漸達(dá)成共識(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂是這一病理生理過(guò)程的中心環(huán)節(jié)。而在嚴(yán)重?zé)齻缙?，血管?nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂主要表現(xiàn)為燒傷后內(nèi)皮細(xì)胞“毛細(xì)血管滲漏”及隨之而來(lái)的間質(zhì)水腫。
　　危重病患者時(shí)常伴有胰島素抵抗和高血糖，而這種“創(chuàng)傷后胰島素抵抗”的嚴(yán)重程度往往反映了這些危重病患者（如嚴(yán)重創(chuàng)

2、傷、嚴(yán)重?zé)齻澳摱景Y）的死亡風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)外科重癥監(jiān)護(hù)病房的前瞻性研究中，人們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化胰島素治療來(lái)嚴(yán)格控制血糖水平可明顯減少嚴(yán)重感染、器官衰竭以及死亡率。在關(guān)于其機(jī)制的探討中，一些研究人員認(rèn)為代謝調(diào)節(jié)機(jī)制是強(qiáng)化胰島素治療的唯一作用途徑。然而，近年來(lái)人們逐漸發(fā)現(xiàn)胰島素還具有抗炎、抗凋亡、促細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的特性。也就是說(shuō)胰島素除了具有代謝調(diào)節(jié)特性外還具有非代謝作用機(jī)制。近期又有研究報(bào)道強(qiáng)化胰島素治療具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用并認(rèn)為其可

3、能是阻止危重病患者多臟器衰竭和死亡的重要機(jī)制。但到目前為止，危重病患者強(qiáng)化胰島素治療的確切機(jī)制仍不清楚。
　　在本課題中，我們主要是探討胰島素對(duì)嚴(yán)重?zé)齻髢?nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的調(diào)節(jié)作用。首先，在體嚴(yán)重?zé)齻麆?dòng)物模型上，利用強(qiáng)化胰島素處理觀察其對(duì)急性肺損傷的作用。我們的設(shè)想是強(qiáng)化胰島素處理是否可以通過(guò)對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)，防止微血管滲漏，從而達(dá)到減輕燒傷后肺組織水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的目的。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步體外利用臍靜脈血管內(nèi)皮

4、細(xì)胞，觀察胰島素干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞單分子通透性與細(xì)胞緊密連接以及凋亡的變化和內(nèi)在聯(lián)系，并就可能存在的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究。
　　方法：
　　1.雄性SD大鼠75只，隨機(jī)分成假燙組、燙傷組（30％TBSAⅢ○），燙傷+胰島素處理組。氧化酶法測(cè)定燙傷后24小時(shí)內(nèi)大鼠血糖變化。燙傷12小時(shí)后，HE染色觀察肺臟病理變化，檢測(cè)肺臟髓過(guò)氧化物酶（MPO）、血清超氧化物歧化酶（SOD）以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量變化。

5、同時(shí)，電鏡觀察肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞變化，比色法檢測(cè)各型一氧化氮合酶及血清一氧化氮（NO）水平。
　　2.體外培養(yǎng)原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），隨機(jī)分為空白對(duì)照組、20％（V/V）人正常血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清+胰島素處理組及抑制劑（LY-294002）組，利用生物素標(biāo)記的BSA測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞單分子通透性變化，羅丹明-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架并觀察，同時(shí)利用蛋白印跡法檢測(cè)帶狀閉合蛋白-

6、1（ZO-1）、咬合蛋白及磷酸化蛋白激酶B（AKT）的變化情況。
　　3.體外培養(yǎng)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），隨機(jī)被分為空白對(duì)照組、20％（V/V）人正常血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清刺激組、20％（V/V）人燒傷血清+胰島素處理組，刺激6小時(shí)后運(yùn)用原位末端標(biāo)記（TUNEL）法觀察內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，分別采用免疫組織化學(xué)染色法和（或）蛋白印跡法檢測(cè)抗凋亡蛋白bcl-2及eNOS的蛋白表達(dá)情況。
　　4.體外原代培

7、養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），隨機(jī)被分為空白對(duì)照組、20％（V/V）正常人血清刺激組、20％（V/V）燒傷人血清刺激組、20％（V/V）燒傷人血清+胰島素（10-7mol/L）處理組及抑制劑（LY-294002）組。ELISA法檢測(cè)采集血清中IL-1β和TNF-α的水平。刺激6小時(shí)后，蛋白印跡法檢測(cè)HUVEC胞漿抑制酶κB-α（IκB-α）和胞核NF-κB-p65的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.強(qiáng)化胰島素處理明顯減

8、輕燒傷后大鼠的肺組織水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。BALF中蛋白含量和肺組織MPO含量明顯減少（P<0.05），而血清SOD增加明顯（P<0.01）。肺微血管透射電鏡下觀察強(qiáng)化胰島素處理組較單純燙傷組內(nèi)皮細(xì)胞受損程度明顯改善。強(qiáng)化胰島素處理組血清NO、血清總一氧化氮合酶(NOS)和結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)含量較單純燙傷組均明顯增加（P<0.01）。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞單分子通透性在燒傷血清刺激下明顯增加，胰島素干預(yù)（1

9、0-7mol/L）可阻斷其損傷效應(yīng)。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，胰島素干預(yù)（10-7mol/L）后燒傷血清刺激引起的內(nèi)皮細(xì)胞張力絲形成減少，ZO-1蛋白表達(dá)降低。應(yīng)用AKT特異性阻斷劑后在阻斷了AKT磷酸化的同時(shí)胰島素的上述保護(hù)效應(yīng)也隨之減弱或消失。
　　3.與空白對(duì)照組比較，燒傷血清可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，bcl-2和p-eNOS蛋白表達(dá)降低（P<0.01）。相對(duì)于單純燒傷血清刺激組，胰島素處理組（10-7mol/L）細(xì)胞凋亡顯著減少，bcl

10、-2和p-eNOS蛋白表達(dá)明顯恢復(fù)（P<0.01）。eNOS在各組中無(wú)明顯變化。
　　4.與空白對(duì)照組比較，燒傷血清誘導(dǎo)了HUVEC的損傷，胞漿p-IκB-α和胞核NF-κB-p65蛋白表達(dá)增多。相對(duì)于單純燒傷血清刺激組，胰島素處理組HUVEC損傷減輕，胞漿IκB-α的磷酸化和NF-κB-p65核移位明顯減輕。AKT特異性抑制劑（LY294002）能夠消除胰島素對(duì)燒傷血清誘導(dǎo)HUVEC的NF-κB-p65核移位抑制作用。
　

11、　結(jié)論:
　　1.在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，強(qiáng)化胰島素處理有效改善嚴(yán)重?zé)齻碌募毙苑螕p傷，其中胰島素的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用可能發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
　　2.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，胰島素通過(guò)PI3K/AKT途徑減輕燒傷血清刺激下的血管通透性增高。其中，內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架重排及緊密連接相關(guān)蛋白的有效保護(hù)是其作用關(guān)鍵，這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)對(duì)燒傷后多臟器衰竭的防治意義重大。
　　3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，胰島素可增加燒傷血清誘導(dǎo)下抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)并抑制