胰島素對(duì)人外周血炎癥細(xì)胞亞群和單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　肥胖和2型糖尿病狀態(tài)下的長期低水平炎癥反應(yīng)是心血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。近年來，關(guān)于人外周血免疫細(xì)胞亞群的研究發(fā)現(xiàn)了許多與炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞亞群，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryTcells,Treg），高表達(dá)CD16的單核細(xì)胞，高表達(dá)CD146的T細(xì)胞等尤其受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)胰島素具有顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用，胰島素是否可以通過對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)而發(fā)揮其抗炎作用尚不明確。有前期研究發(fā)現(xiàn)胰島素療法

2、可以增加外周血CD34+干/祖細(xì)胞數(shù)量，而胰島素是否對(duì)CD34+細(xì)胞有直接動(dòng)員作用尚待明確。
　　另外，單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，而胰島素對(duì)其調(diào)控作用目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。
　　因此，本研究擬探討上述炎癥細(xì)胞亞群在人群中的分布規(guī)律并探討胰島素靜脈輸注是否可以對(duì)上述細(xì)胞亞群水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)探討胰島素對(duì)人單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響。
　　方法：
　　第一部分：外周血炎癥細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞分析及優(yōu)

3、化
　　探討保存時(shí)間、紅細(xì)胞裂解、固定/透膜液選擇對(duì)流式細(xì)胞染色的影響及對(duì)TLR2和TLR4在不同細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行初步觀察，優(yōu)化確定本課題的流式細(xì)胞染色方案，并對(duì)各細(xì)胞亞群在健康人群中的表達(dá)進(jìn)行初步分析。
　　第二部分：炎癥細(xì)胞亞群在代謝綜合征及2型糖尿病人群中的分布及增齡變化
　　招募代謝綜合征、2型糖尿病及健康受試者，通過流式細(xì)胞技術(shù)觀察外周血Treg細(xì)胞、CD16+單核細(xì)胞、CD146+T細(xì)胞、CD34+干/祖細(xì)胞

4、等水平，及單核細(xì)胞中TLR2、TLR4的表達(dá)。進(jìn)行組間比較，并對(duì)一般資料、血清指標(biāo)和流式細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　第三部分：胰島素輸注對(duì)人外周血炎癥細(xì)胞亞群的影響
　　給予非糖尿病肥胖受試者輸注胰島素（與葡萄糖同時(shí)輸注以防止低血糖）14小時(shí)，分離0、4、8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的新鮮單個(gè)核細(xì)胞，行流式細(xì)胞染色觀察，同時(shí)觀察NF-κB核轉(zhuǎn)位和血漿炎癥分子水平。受試者間隔2周再次接受單純葡萄糖或生理鹽水輸注作為對(duì)照。
　　第四部分

5、：胰島素對(duì)單核-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響及機(jī)制探討
　　通過CFDA-SE標(biāo)記法觀察胰島素和/或LPS對(duì)HAEC和THP-1細(xì)胞粘附的影響。通過共培養(yǎng)與流式細(xì)胞分選，real-timePCR，觀察共培養(yǎng)的HAEC細(xì)胞ICAM-1、TNF-α和THP-1細(xì)胞TNF-α、SOCS-3的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　細(xì)胞即時(shí)染色并固定，4℃保存過夜可保證時(shí)間差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最小，F(xiàn)icoll分選單個(gè)核細(xì)胞后

6、染色比全血染色及紅細(xì)胞裂解的染色效果更為穩(wěn)定。我們檢測(cè)到的健康人外周血各炎癥細(xì)胞亞群的水平與文獻(xiàn)報(bào)道相符。
　　第二部分
　　CD146+T細(xì)胞在2型糖尿病組的水平顯著高于其余兩組。CD34+干/祖細(xì)胞在2型糖尿病組呈下降趨勢(shì)，TLR2及TLR4在2型糖尿病組有上升趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Treg細(xì)胞和CD16+單核細(xì)胞在三組間無顯著差異。
　　CD34+細(xì)胞水平與年齡負(fù)相關(guān)，CD146+T細(xì)胞水平與年齡正相關(guān)。Treg

7、水平與血糖負(fù)相關(guān)。CD16+/CD14+單核細(xì)胞水平與甘油三酯負(fù)相關(guān)。
　　第三部分
　　胰島素輸注可以上調(diào)Treg水平，下調(diào)炎癥性單核細(xì)胞水平，抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κB的胞核轉(zhuǎn)位和血漿MMP-9、MCP-1表達(dá)。但胰島素輸注對(duì)于CD146+T細(xì)胞水平并未產(chǎn)生顯著影響。胰島素輸注在8小時(shí)內(nèi)未對(duì)CD34+干/祖細(xì)胞水平產(chǎn)生影響。TLR2及TLR4未產(chǎn)生顯著改變。
　　第四部分
　　LPS干預(yù)4小時(shí)可以促進(jìn)TH

8、P-1細(xì)胞與HAEC的粘附，而胰島素可以劑量依賴性地顯著抑制LPS對(duì)THP-1/HAEC粘附的刺激作用。
　　胰島素體外干預(yù)4小時(shí)下調(diào)HAEC的ICAM-1及TNF-α表達(dá)，下調(diào)THP-1細(xì)胞的TNF-α及SOCS-3表達(dá)并抑制LPS的上調(diào)作用。
　　結(jié)論：
　　1.對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)人外周血標(biāo)本的流式細(xì)胞比較研究，采用即時(shí)分離單個(gè)核細(xì)胞染色并固定的方法，可以更好地減少混雜因素干擾。
　　2.人外周血各炎癥細(xì)胞亞群在

9、代謝綜合征和2型糖尿病狀態(tài)下及隨著年齡增加發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)為CD146+T細(xì)胞在2型糖尿病狀態(tài)下上調(diào)及隨年齡增加而上調(diào)，Treg水平隨血糖升高而下降，CD34+干/祖細(xì)胞水平隨年齡增加而下調(diào)，提示代謝綜合征、2型糖尿病及高齡時(shí)的高炎癥狀態(tài)及體內(nèi)抗炎、修復(fù)能力的增齡性下降。
　　3.胰島素輸注可以上調(diào)人外周血的Treg水平并下調(diào)炎癥性單核細(xì)胞水平，提示胰島素的抗炎作用新機(jī)制。同時(shí)胰島素輸注對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位和M