巴馬小型豬皮膚模型瘢痕與正常皮膚差異表達基因譜的檢測與分析.pdf

1、目的:建立巴馬小型豬背部皮膚瘢痕模型，利用表達譜基因芯片技術，篩選巴馬小型豬皮膚瘢痕組織與正常皮膚組織差異表達的相關基因及通路，選取感興趣的差異基因，驗證芯片的結果，探討其在瘢痕形成過程中可能的作用。
　　方法:取6只4月齡健康巴馬小型豬，10～12kg，在背部兩側制備創(chuàng)面，左右兩側分別對稱性制備6～8塊創(chuàng)面，大小均為3×3 cm。背部右側燙傷創(chuàng)面的制備，使用特制燙傷儀制備燒傷創(chuàng)面，將燙傷儀燙頭溫度設定為100℃，燙頭接觸時間為2

2、0秒;背部左側采用手術刀切割方式切取非全厚皮片，將創(chuàng)面所揭除的皮片作為正常皮膚標本保存進入后續(xù)實驗，制備的創(chuàng)面止血處理后，暴露待其自然愈合，觀察創(chuàng)面愈合情況;建模第21天、56天分別從動物背部皮膚創(chuàng)面組織中央部位采集創(chuàng)傷愈合及瘢痕組織標本。常規(guī)切片染色行形態(tài)學觀察，提取正常皮膚與切割傷和燒燙傷的第56天瘢痕組織的總RNA并合成雙鏈cDNA，體外轉錄合成生物素標記cRNA，與Affymetrix公司的GeneChip(R)Porcine

3、Genome Array表達譜芯片進行雜交，分析篩選出瘢痕組織的差異表達基因，GO功能富集分析法對差異表達基因進行分析，KEGG通路分析了解兩者的差異。根據(jù)生物信息學選取KEGG通路分析富集的Hippo信號通路中部分有代表意義的基因通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和免疫組織化學法做功能驗證。
　　結果:1、大體觀察:建模第56天觀創(chuàng)面，中央可見增生組織，凸出豬背部皮膚表面，呈條索狀，質(zhì)韌;HE染色鏡下見真皮乳頭消失，膠原纖

4、維增多，提示建模成功。
　　2、表達譜芯片結果數(shù)據(jù)分析:第56天巴馬小型豬背部皮膚瘢痕與正常皮膚組織相比，共篩選出897個差異表達基因，其中234個表達上調(diào)，663個表達下調(diào)。
　　3、GO功能分析結果顯示，主要參與皮膚發(fā)育、表皮細胞分化、負調(diào)節(jié)代謝過程等生物過程，大部分基因位于細胞連接、離子通道復合物、多聚核糖體等細胞成分中，涉及金屬酶、淀粉酶活性的調(diào)節(jié)等分子功能。
　　4、KEGG通路分析結果顯示差異基因顯著富集于

5、15個通路，主要涉及Hippo信號通路，TGF-β信號通路、花生四烯酸代謝、氨基酸的代謝等通路。
　　5、實時熒光PCR結果顯示:與正常皮膚相比，第56天瘢痕組織中CTGF、BMP-7、ID1、CDH1的mRNA表達均有差異(P＜0.05)，且與基因芯片結果一致，CTGFmRNA表達呈上調(diào)趨勢，BMP-7、ID1、CDH1的mRNA表達呈下調(diào)趨勢，驗證了基因芯片檢測結果。
　　6、免疫組織化學結果顯示:與正常皮膚相比，第56