犬骨髓EPCs分離、培養(yǎng)、鑒定及其表面標(biāo)志物CD133在非血管化輸送盤牽張成骨中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　從健康犬的骨髓血中分離出內(nèi)皮祖細(xì)胞，進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增培養(yǎng)，為課題組其他實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)材料，復(fù)制犬下頜骨非血管化輸送盤牽張成骨動(dòng)物模型，設(shè)計(jì)制作犬下頜骨損傷模型，通過內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133在牽張區(qū)及損傷區(qū)的表達(dá)初步研究犬下頜骨非血管化輸送盤牽張成骨的過程中EPCs的存在及變化，為EPCs在非血管化輸送盤牽張成骨的作用研究提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　選健康1～2歲的本地雜種犬，經(jīng)由脛骨抽取骨髓，應(yīng)用犬淋

2、巴細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，用特殊誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得單個(gè)核細(xì)胞獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞并擴(kuò)增培養(yǎng)。每日通過倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)中細(xì)胞;應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定目標(biāo)細(xì)胞表面標(biāo)志物(CD34，CD133);激光共聚焦顯微鏡觀察其攝取DIL-AC-LDL，結(jié)合FITC-Lectin-UEA-1實(shí)驗(yàn);通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖活性。
　　選用健康1～2歲的本地雜種犬18只，將其隨機(jī)分成2組分別為:非血管化輸送盤牽張成骨組與缺損模型組，

3、每組9只，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1周，2周，4周）3只。術(shù)中在犬右側(cè)下頜骨下緣制備長(zhǎng)約25.0mm×10.0mm的部分頜骨缺損，于缺損區(qū)遠(yuǎn)中端制備一10.0mm×15.0mm的非血管化輸送盤，根據(jù)牽張組及損傷組的分組，牽張組動(dòng)物術(shù)中安裝內(nèi)置牽張器，5天后開始以1.0mm/天/次速度向近中連續(xù)牽張修復(fù)缺損;缺損組動(dòng)物術(shù)中將非血管化輸送盤用鈦板直接固定在缺損近中端。牽張結(jié)束及術(shù)后按著計(jì)劃的天數(shù)分別處死動(dòng)物并制取標(biāo)本，進(jìn)行大體觀察、CD

4、133免疫組化檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　犬骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞體外分離、鑒定及擴(kuò)增培養(yǎng):新分離出的單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，大小不一，漂浮于培養(yǎng)基中，24小時(shí)后部分細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)有梭形、三角形、紡錘形等，3～7天細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，出現(xiàn)細(xì)胞集落。中間細(xì)胞較邊緣細(xì)胞圓，邊緣細(xì)胞出芽樣伸出，類似血島樣結(jié)構(gòu)。8～12天細(xì)胞逐漸張滿培養(yǎng)瓶，呈典型的鵝卵石樣外觀，細(xì)胞呈鋪路石樣。14天，細(xì)胞排列緊密，有毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞結(jié)果

5、顯示細(xì)胞CD34、CD133呈陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形。細(xì)胞能夠攝取DIL-AC-LDL，結(jié)合FITC-Lectin-UEA-1。
　　EPCs在非血管化輸送盤牽張成骨牽張區(qū)表達(dá)的研究:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均完成牽張成骨過程，傷口無(wú)感染，動(dòng)物均存活至計(jì)劃取材時(shí)。固定于下頜骨的內(nèi)置牽張器無(wú)松動(dòng)，無(wú)損壞。通過CD133免疫組化檢測(cè)，陽(yáng)性率牽張成骨組＞缺損模型組，而陽(yáng)性率從高到低一周組＞兩周組＞四周組。
　　結(jié)論：
　　1、初步