犬骨髓EPCs分離、培養(yǎng)、鑒定及其表面標志物CD133在非血管化輸送盤牽張成骨中表達的研究.pdf

1、目的：
　　從健康犬的骨髓血中分離出內皮祖細胞，進行鑒定，擴增培養(yǎng)，為課題組其他實驗提供實驗材料，復制犬下頜骨非血管化輸送盤牽張成骨動物模型，設計制作犬下頜骨損傷模型，通過內皮祖細胞表面標志物CD133在牽張區(qū)及損傷區(qū)的表達初步研究犬下頜骨非血管化輸送盤牽張成骨的過程中EPCs的存在及變化，為EPCs在非血管化輸送盤牽張成骨的作用研究提供理論基礎。
　　方法：
　　選健康1～2歲的本地雜種犬，經由脛骨抽取骨髓，應用犬淋

2、巴細胞分離液采用密度梯度離心法分離出單個核細胞，用特殊誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得單個核細胞獲得內皮祖細胞并擴增培養(yǎng)。每日通過倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)中細胞;應用流式細胞儀鑒定目標細胞表面標志物(CD34，CD133);激光共聚焦顯微鏡觀察其攝取DIL-AC-LDL，結合FITC-Lectin-UEA-1實驗;通過細胞增殖實驗觀察細胞增殖活性。
　　選用健康1～2歲的本地雜種犬18只，將其隨機分成2組分別為:非血管化輸送盤牽張成骨組與缺損模型組，

3、每組9只，根據實驗要求每組每個時間點（1周，2周，4周）3只。術中在犬右側下頜骨下緣制備長約25.0mm×10.0mm的部分頜骨缺損，于缺損區(qū)遠中端制備一10.0mm×15.0mm的非血管化輸送盤，根據牽張組及損傷組的分組，牽張組動物術中安裝內置牽張器，5天后開始以1.0mm/天/次速度向近中連續(xù)牽張修復缺損;缺損組動物術中將非血管化輸送盤用鈦板直接固定在缺損近中端。牽張結束及術后按著計劃的天數(shù)分別處死動物并制取標本，進行大體觀察、CD

4、133免疫組化檢測。
　　結果：
　　犬骨髓來源內皮祖細胞體外分離、鑒定及擴增培養(yǎng):新分離出的單個核細胞呈圓形，大小不一，漂浮于培養(yǎng)基中，24小時后部分細胞開始貼壁生長，形態(tài)有梭形、三角形、紡錘形等，3～7天細胞生長迅速，出現(xiàn)細胞集落。中間細胞較邊緣細胞圓，邊緣細胞出芽樣伸出，類似血島樣結構。8～12天細胞逐漸張滿培養(yǎng)瓶，呈典型的鵝卵石樣外觀，細胞呈鋪路石樣。14天，細胞排列緊密，有毛細血管管腔樣結構。流式細胞儀檢測細胞結果

5、顯示細胞CD34、CD133呈陽性表達。細胞生長曲線呈“S”形。細胞能夠攝取DIL-AC-LDL，結合FITC-Lectin-UEA-1。
　　EPCs在非血管化輸送盤牽張成骨牽張區(qū)表達的研究:實驗動物均完成牽張成骨過程，傷口無感染，動物均存活至計劃取材時。固定于下頜骨的內置牽張器無松動，無損壞。通過CD133免疫組化檢測，陽性率牽張成骨組＞缺損模型組，而陽性率從高到低一周組＞兩周組＞四周組。
　　結論：
　　1、初步