OLETF大鼠“IGT腎病”的特點(diǎn)及發(fā)病機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）的慢性微血管并發(fā)癥之一，已成為終末期腎?。╡ndstage renaldisease，ESRD）的首位病因，目前仍缺乏有效的治療手段，確切的發(fā)病機(jī)制也尚未闡明。微量白蛋白尿（microalbuminuria，MAU）是目前臨床診斷早期DN的指標(biāo)，然而越來(lái)越多的證據(jù)顯示，MAU預(yù)測(cè)DN的進(jìn)展既不敏感，也缺乏特異性

2、。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在確診 DM之前或同時(shí)，部分患者已經(jīng)出現(xiàn)腎臟損傷的臨床表現(xiàn)，如蛋白尿等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，DM前期腎臟已有不同程度的結(jié)構(gòu)改變，且腎小管及間質(zhì)的病變對(duì)DN的發(fā)生發(fā)展起至關(guān)重要的作用，已成為早期腎功能異常的預(yù)測(cè)因子。本研究以自發(fā)2型DM動(dòng)物模型OLETF大鼠為對(duì)象，動(dòng)態(tài)觀察在正常糖耐量（normalglucosetolerance，NGT）期、糖耐量減低（impaired glucose tolerance，IGT）期、DM期

3、、DN期腎組織結(jié)構(gòu)及功能的變化，旨在探討 IGT期 OLETF大鼠腎臟病變的特點(diǎn)及可能發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1)雄性清潔級(jí)OLETF大鼠45只，LETO大鼠30只，在無(wú)特定病原體級(jí)條件下按5只/籠飼養(yǎng)，LETO大鼠予普通飼料飲食，OLETF大鼠予高脂飼料飲食。LETO大鼠與 OLETF大鼠同系不同株，不發(fā)生 DM，作為OLETF大鼠的正常對(duì)照組。
　　2)每周測(cè)量大鼠體重，剪尾測(cè)空腹血糖（fasting bloo

4、dglucose，F(xiàn)BG）；每2周留取24h尿和隨機(jī)尿，生化法檢測(cè)24h尿微量白蛋白（urinary microalbumin，UMA）、視黃醇結(jié)合蛋白（retinol binding protein，RBP）、β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glucosaminidase，NAG）；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-linked immunos

5、orbent assay，ELISA）檢測(cè)尿胱抑素C（CystatinC，CysC）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）；每2周空腹內(nèi)眥取血，生化法檢測(cè)血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）、甘油三酯（triglyeride，TG）、總膽固醇（total cholestero

6、l，TC）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）；ELISA檢測(cè)血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）；每4周行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT），放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS），定義葡萄糖負(fù)荷后血糖峰值>16.8mmol/L，120

7、min血糖>11.1mmol/L，符合二者之一確定為IGT模型，兩者均符合確定為DM模型，至兩組大鼠24hUMA含量出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異后定義為DN。
　　3)分別在OLETF大鼠NGT、IGT、DM和DN期時(shí)各處死6只OLETF大鼠及6只與OLETF大鼠同周齡的LETO大鼠。留取腎組織，計(jì)算腎指數(shù)評(píng)估腎臟肥大程度；用光鏡、透射電鏡觀察大鼠腎臟的病理變化；免疫組化法檢測(cè)不同時(shí)期腎小管重吸收蛋白Megalin、Cubilin的表達(dá)。

8、>　　4)免疫組化法檢測(cè)不同時(shí)期腎小管及間質(zhì)胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate，IRS-1）、絲氨酸磷酸化的IRS-1（serine phosphorylation of IRS-1，pSerIRS-1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和缺

9、氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1) OGTT結(jié)果比較：8周齡OLETF大鼠OGTT各點(diǎn)血糖值均正常，與同周齡LETO大鼠無(wú)差異（P>0.05），符合NGT模型。30周齡OLETF大鼠除FBG未見升高外，其余各點(diǎn)血糖值均高于同周齡LETO大鼠（P<0.05），高峰值為18.25±4.08 mmol/L，120min血糖值為9.56±2.06

10、 mmol/L，符合IGT模型。56及65周齡的OLETF大鼠，各點(diǎn)血糖值均高于相應(yīng)周齡的LETO大鼠（P<0.05），高峰值分別為18.60±3.93 mmol/L、19.35±5.17 mmol/L，120min血糖值分別為13.26±6.72 mmol/L、13.55±6.66 mmol/L，均達(dá)到DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　2)尿蛋白含量比較：NGT期OLETF大鼠24hUMA與同周齡LETO大鼠無(wú)差異（P>0.05），IGT期2

11、4hUMA開始出現(xiàn)升高趨勢(shì)，DM期24hUMA繼續(xù)升高，但均與相應(yīng)周齡LETO大鼠無(wú)差異（P>0.05），至DN期OLETF大鼠24hUMA明顯高于同周齡LETO大鼠（P<0.05）。
　　3)一般資料比較：OLETF大鼠的體重、FINS、TNF-α、IL-6、FFA、TG、TC和腎指數(shù)在IGT期均升高，高于同周齡LETO大鼠及NGT期OLETF大鼠（P<0.05）。其中TNF-α、IL-6在DM期高于IGT期（P<0.05），I

12、L-6、TC在DN期高于DM期（P<0.05）。而FINS在DM期開始下降，低于IGT期（P<0.05），DN期則較DM期進(jìn)一步降低（P<0.05）。
　　4) IGT期OLETF大鼠腎臟H&E染色結(jié)果：腎小球基底膜厚度正常，體積輕度增大，系膜細(xì)胞輕度增生，腎小管上皮細(xì)胞皮質(zhì)刷狀緣脫落，皮質(zhì)、髓質(zhì)出現(xiàn)空泡顆粒和壞死，間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)和動(dòng)脈血管壁輕度增厚，未見明顯間質(zhì)纖維化和水腫。
　　5) IGT期 OLETF大鼠腎臟電鏡

13、結(jié)果：腎小球?yàn)V過(guò)膜厚度均勻，三層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮細(xì)胞及足細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)良好，足突分布均勻，系膜區(qū)面積增大，細(xì)胞數(shù)未見增多，細(xì)胞體積較大，系膜基質(zhì)分泌量輕度增多，腎小管細(xì)胞排列已不整齊，小管基膜增厚，小管內(nèi)褶紊亂，胞質(zhì)內(nèi)含溶酶體顆粒，部分線粒體內(nèi)外膜降解，部分嵴與基質(zhì)降解呈均質(zhì)絮狀，線粒體附件有糖原顆粒沉積，間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)外核膜間的核周間隙擴(kuò)張，血管內(nèi)紅細(xì)胞淤滯，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　6) IGT期腎小球功能損傷指標(biāo)比較：IGT期

14、 OLETF大鼠與同周齡 LETO大鼠及NGT期OLETF大鼠相比，SCr、BUN、24hUMA等常規(guī)腎功能指標(biāo)均未見升高（P>0.05）。
　　7) IGT期腎小管上皮細(xì)胞損傷指標(biāo)比較：IGT期 OLETF大鼠與同周齡LETO大鼠及NGT期OLETF大鼠相比，尿NAG、NGAL水平升高（P<0.05）。
　　8) IGT期腎小管重吸收功能損傷指標(biāo)比較：IGT期 OLETF大鼠與同周齡LETO大鼠及NGT期OLETF大鼠相比

15、，尿RBP、CysC水平升高（P<0.05），β2-MG雖呈升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，腎小管重吸收蛋白Megalin和Cubilin表達(dá)減少（P<0.05）。
　　9) IGT期OLETF大鼠腎臟胰島素抵抗程度：IGT期OLETF大鼠與LETO大鼠及NGT期OLETF大鼠相比，腎小管及間質(zhì)IRS-1、eNOS蛋白表達(dá)減少（P<0.05），pSer IRS-1蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。
　　10) IGT期OLETF大鼠腎

16、小管上皮細(xì)胞缺血缺氧損傷程度：IGT期OLETF大鼠與LETO大鼠及NGT期OLETF大鼠相比，腎小管上皮細(xì)胞HIF-1α、iNOS蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1)成功建立2型DM和2型DN模型，OLETF大鼠24hUMA的特點(diǎn)及腎臟形態(tài)學(xué)改變符合人類2型DN的臨床及病理表現(xiàn)。
　　2)在OLETF大鼠DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，存在慢性炎癥反應(yīng)，且炎癥反應(yīng)程度隨病程的進(jìn)展持續(xù)存在并逐漸加重。
　　3

17、)在DM前期的IGT階段，OLETF大鼠即已出現(xiàn)腎臟損傷，相對(duì)于DN，將此期出現(xiàn)的腎臟結(jié)構(gòu)損傷及功能改變稱之為“IGT腎病”。
　　4) IGT期腎臟結(jié)構(gòu)損傷以腎小管及間質(zhì)的病變?yōu)橹?，功能改變主要為尿中腎小管上皮細(xì)胞損傷指標(biāo)NAG、NGAL水平升高，尿中腎小管重吸收功能損傷指標(biāo)RBP、CysC水平增加以及腎小管重吸收蛋白Megalin、Cubilin表達(dá)下降，而SCr、BUN、24hUMA未見明顯增加。
　　5) IGT期腎