鉛致阿爾茨海默癥樣變神經(jīng)毒性及對相關(guān)通路蛋白表達的影響.pdf

1、鉛是一種常見的神經(jīng)毒物，對神經(jīng)系統(tǒng)具有異常親和力，可誘發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙和學(xué)習(xí)認(rèn)知功能損傷。學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知是高級中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的基本體現(xiàn)。海馬不僅是學(xué)習(xí)記憶發(fā)生與認(rèn)知功能塑形的關(guān)鍵場所，也是鉛神經(jīng)毒性作用的主要靶位點。
　　胰島素/Pi3k/Akt和MAPKs信號通路的活化表達是細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等過程發(fā)生和發(fā)展的分子基礎(chǔ)，其表達紊亂或活化異?？蓪?dǎo)致一系列疾病狀態(tài)及病理表現(xiàn)的發(fā)生。
　　阿爾茨海默癥（Alzhei

2、mer?s disease，AD）是一種原發(fā)型進行性神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病受環(huán)境和遺傳因素的共同調(diào)節(jié)。進行性認(rèn)知功能障礙，及學(xué)習(xí)記憶能力損傷是AD的典型臨床癥狀，該過程中常伴隨Tau蛋白過磷酸化、神經(jīng)元大量凋亡、突觸結(jié)構(gòu)/功能退化及通路蛋白表達異常。雖然AD發(fā)病機制尚不清楚，但大量研究數(shù)據(jù)提示，Aβ表達異常和蓄積可能是各種原因誘導(dǎo)AD發(fā)病的共同通路。
　　近期研究發(fā)現(xiàn)，AD可能并不屬于單純的老年型疾病，其發(fā)病亦具有一定的胚胎源性，

3、這符合成人疾病的胚胎基礎(chǔ)假說（FeBAD）的論述。已知孕哺期鉛暴露會誘發(fā)嚴(yán)重影響子代中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育；且人群研究結(jié)果證實發(fā)育早期鉛暴露與兒童智力損傷，空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙、認(rèn)知和注意力下降具有強相關(guān)性，但該機制尚不十分清楚。
　　本研究擬運用小鼠孕哺期鉛暴露模型和PC12細(xì)胞染毒模型，檢測孕早期鉛暴露對子代小鼠血鉛和海馬鉛含量、海馬Aβ相關(guān)蛋白（IDE）和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白（NGF）表達的影響；結(jié)合體外實驗，觀察鉛暴露對神經(jīng)細(xì)

4、胞生長發(fā)育的影響，探討該過程中可能涉及的AD相關(guān)蛋白，神經(jīng)發(fā)育相關(guān)因子及MAPKs信號通路蛋白表達變化，對鉛的細(xì)胞和神經(jīng)毒性進行闡述和分析，為AD發(fā)病機理的探討及神經(jīng)功能修復(fù)提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.通過構(gòu)建鉛中毒動物模型，比較孕哺期鉛暴露對仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，檢測各濃度鉛暴露組海馬IDE和NGF的差異表達，評估孕哺期母體鉛暴露對子代小鼠神經(jīng)元發(fā)育和功能表達的影響，進而說明鉛的致AD樣病變作用。
　　2.

5、通過構(gòu)建體外細(xì)胞染毒模型，分析對比不同劑量及不同時間鉛暴露對AD相關(guān)細(xì)胞因子，神經(jīng)發(fā)育相關(guān)因子和胞內(nèi)信號蛋白表達的影響，探索鉛暴露對Aβ及其衍生物表達的影響，說明鉛致AD樣病變作用并探討其對信號傳導(dǎo)通路表達的影響，為AD的防治和鉛毒性的干預(yù)治療提供線索。
　　材料與方法：
　　1.研究對象
　　動物模型：將懷孕SPF級昆明小鼠隨機分為4組，每組10只，1個對照組及3個鉛暴露組。孕鼠自懷孕第1d起（E0）至仔鼠斷乳時，分

6、別給予醋酸鉛含量為0％（對照組）、0.1%（低劑量組）、0.2%（中劑量組）和0.5%（高劑量組）的去離子飲用水。仔鼠出生后仍由母鼠喂養(yǎng)照料至PND21。
　　細(xì)胞株：選用褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株作為實驗對象，經(jīng)分化處理后，分別給予終濃度為0μM、20μM、100μM和500μM的醋酸鉛染毒。
　　2.方法：
　　2.1.動物實驗
　　2.1.1.采用Z-5000石墨爐原子吸收光譜儀測定仔鼠血鉛和海馬

7、鉛濃度。
　　2.1.2.采用Morris水迷宮實驗評價仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　2.1.3.采用Western Blot檢測IDE和NGF在不同劑量鉛暴露組中的表達量。分別采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)對IDE和NGF在海馬組織中的分布和表達進行了描述（對照組和高劑量組）。
　　2.2.細(xì)胞實驗
　　2.2.1.采用MTT法檢測不同暴露濃度及暴露時間對細(xì)胞活性的影響。
　　2.2.2.采用Western Bl

8、ot技術(shù)檢測AD相關(guān)蛋白（Aβ和Aβ寡聚體），神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白（IGF1/IGF1R）及胞內(nèi)信號通路相關(guān)蛋白（IR、p-Akt、IDE、ERK1/2、JNK1/2/3、P38）蛋白表達的改變，采用實時定量PCR分析APP、INSR、IDE和IGF1/IGF1R基因mRNA的表達。
　　3.統(tǒng)計分析
　　實驗使用SPSS21.0軟件包（SPSS Inc，USA）進行統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用單

9、因素方差分析，兩兩比較使用Bonferroni檢驗法，若不滿足正態(tài)分布，則使用秩和檢驗，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，檢驗水平為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.動物實驗結(jié)果
　　1.1.孕哺期母體鉛暴露對仔鼠血鉛、海馬鉛含量及其學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　不同劑量孕哺期鉛暴露后，PND21仔鼠血鉛和海馬鉛含量顯著高于對照組(P<0.05）。Morris水迷宮結(jié)果顯示，中、高暴露劑量組仔鼠的逃避

10、潛伏期和錯誤次數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05）。
　　1.2.孕哺期母體鉛暴露對仔鼠海馬組織IDE和NGF蛋白表達的影響
　　1.2.1.Western Blot結(jié)果顯示，各鉛暴露組仔鼠海馬IDE和NGFβ蛋白表達水平較對照組均明顯降低（P<0.05）。
　　1.2.2.免疫組化結(jié)果顯示，高劑量鉛暴露組仔鼠海馬CA1區(qū)NGF免疫組化陽性反應(yīng)物的平均灰度值明顯低于對照組（P<0.05）。
　　1.2.3.免疫熒光

11、實驗結(jié)果顯示，高劑量鉛暴露組仔鼠海馬神經(jīng)元活性劑IDE免疫熒光抗體的平均光密度均顯著低于對照組（P<0.05）。
　　2.細(xì)胞實驗結(jié)果
　　1.醋酸鉛處理對PC12細(xì)胞增殖的影響
　　根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量變化及形態(tài)學(xué)改變最終選擇0μM、20μM、100μM和500μM醋酸鉛暴露濃度及12h、24h和72h來開展后續(xù)研究。
　　2.醋酸鉛處理對PC12細(xì)胞Aβ和Aβ寡聚體表達的影響
　　不同濃度醋酸鉛暴露12h后，

12、500μM染鉛組PC12細(xì)胞Aβ的表達低于對照組（P<0.05）；Aβ寡聚體蛋白在20μM染鉛組細(xì)胞中的表達低于對照組（P<0.05），100μM和500μM染鉛組PC12細(xì)胞Aβ蛋白的表達水平高于對照組（P<0.05）。
　　染毒24h后，各染鉛組細(xì)胞Aβ的表達水平均低于對照組（P<0.05）；Aβ寡聚體蛋白在各染鉛組細(xì)胞中的表達無明顯改變（P＞0.05）。
　　染毒72h后，Aβ蛋白在100μM和500μM染鉛組細(xì)胞中的

13、表達低于對照組（P<0.05）；Aβ寡聚體蛋白在各染鉛組細(xì)胞中的表達均高于對照組（P<0.05）。
　　3.醋酸鉛處理對PC12細(xì)胞IGF1/IGF1R表達的影響
　　醋酸鉛暴露12h后，20μM染鉛組PC12細(xì)胞IGF1的表達高于對照組（P<0.05）， IGF1和IGF1R蛋白在100μM和500μM染鉛組細(xì)胞中的表達均低于對照組（P<0.05）。
　　染毒24h后，IGF1蛋白在各染鉛組細(xì)胞中的表達均低于對照組（

14、P<0.05）；IGF1R蛋白在20μM和500μM染鉛組細(xì)胞中的表達低于對照組（P<0.05）。
　　染毒72h后，IGF1蛋白在各染鉛組細(xì)胞中的表達均低于對照組（P<0.05）；100μM和500μM染鉛組細(xì)胞IGF1R的表達低于對照組（P<0.05）。
　　4.醋酸鉛處理對PC12細(xì)胞IR、p-Akt、IDE表達的影響
　　染毒12h后，20μM染鉛細(xì)胞IR的表達低于對照組（P<0.05），100μM染鉛組細(xì)胞I

15、R和p-Akt蛋白表達水平均高于對照組（P<0.05）；500μM染鉛組細(xì)胞p-Akt的表達低于對照組（P<0.05）；500μM染鉛組細(xì)胞IDE的表達低于對照組（P<0.05）。
　　染毒24h后，20μM及100μM染鉛組細(xì)胞IR的表達低于對照組（P<0.05）；p-Akt蛋白在20μM和100μM染鉛組細(xì)胞中的表達顯著高于對照組（P<0.05），500μM染鉛組細(xì)胞p-Akt的表達量則明顯低于對照組（P<0.05）；IDE蛋

16、白在各染鉛組細(xì)胞中的表達均低于對照組（P<0.05）。
　　染毒72h后，IR蛋白在20μM和500μM染鉛組細(xì)胞中的表達低于對照組（P<0.05）；p-Akt蛋白在500μM染鉛組細(xì)胞中的表達低于對照組（P<0.05）；100μM及500μM染鉛組細(xì)胞IDE的表達低于對照組（P<0.05）。
　　5.醋酸鉛處理對PC12細(xì)胞MAPK信號通路相關(guān)蛋白(ERK1/2、JNK1/2/3、P38）表達的影響
　　不同濃度醋酸

17、鉛處理12h后，與對照組比較，各染鉛組細(xì)胞ERK1的表達增高，而ERK2和P38蛋白表達降低（P<0.05）；500μM染鉛組細(xì)胞JNK1的表達低于對照組（P<0.05）；20μM及100μM染鉛組細(xì)胞JNK2的表達高于對照組（P<0.05）；100μM及500μM染鉛組細(xì)胞JNK3的表達低于對照組（P<0.05）。
　　染毒24h后，與對照組比較，20μM染鉛組細(xì)胞ERK1表達顯著升高，而500μM染鉛組細(xì)胞ERK1蛋白表達降低

18、（P<0.05）；ERK2蛋白在各染鉛組細(xì)胞中的表達均低于對照組（P<0.05）；100μM及500μM染鉛組細(xì)胞JNK1的表達低于對照組（P<0.05）；500μM染鉛組細(xì)胞JNK2蛋白的表達低于對照組（P<0.05）；20μM及500μM染鉛組細(xì)胞JNK3的表達低于對照組（P<0.05）；P38蛋白在100μM和500μM染鉛組細(xì)胞中的表達低于對照組（P<0.05）。
　　染毒72h后，與對照組比較，各染鉛組細(xì)胞ERK2及JN

19、K1蛋白的表達均降低（P<0.05）；500μM染鉛組細(xì)胞ERK1的表達低于對照組（P<0.05）；100μM染鉛組細(xì)胞JNK2的表達高于對照組（P<0.05），500μM染鉛組細(xì)胞JNK2的表達低于對照組（P<0.05）；JNK3蛋白在100μM及500μM染鉛組細(xì)胞中的表達均低于對照組（P<0.05）；100μM及500μM染鉛組細(xì)胞P38的表達低于對照組（P<0.05）。
　　6.醋酸鉛對PC12細(xì)胞APP、INSR、AKT

20、、IDE和IGF1/IGF1R轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　PCR結(jié)果顯示，醋酸鉛處理12h后，APP mRNA在各染鉛組細(xì)胞中的表達無明顯改變（P>0.05）；20μM染鉛組細(xì)胞INSR mRNA的表達低于對照組（P<0.05）；各染鉛組細(xì)胞AKT mRNA的表達均低于對照組（P<0.05）；各實驗組細(xì)胞IDE mRNA的表達無顯著差異（P＞0.05）；20μM和100μM染鉛組細(xì)胞IGF1/IGF1RmRNA的表達均低于對照組（P<0.

21、05）。
　　染毒24h后，20μM及100μM染鉛組細(xì)胞APP mRNA的表達高于對照組（P<0.05）；100μM染鉛組細(xì)胞INSR mRNA的表達低于對照組（P<0.05）；20μM 及100μM染鉛組細(xì)胞AKT mRNA的表達低于對照組（P<0.05）；20μM染鉛組細(xì)胞IDE mRNA的表達低于對照組（P<0.05）；100μM染鉛組細(xì)胞IGF1 mRNA的表達低于對照組（P<0.05），各實驗組細(xì)胞IGF1R

22、 mRNA的表達無明顯差異（P＞0.05）。
　　染毒72h后，20μM及100μM染鉛組細(xì)胞APP mRNA的表達均低于對照組（P<0.05）；僅20μM染鉛組細(xì)胞INSR mRNA的表達低于對照組（P<0.05）；AKT mRNA在20μM及100μM染鉛組細(xì)胞中的表達低于對照組（P<0.05）；IDE mRNA在各實驗組中的表達無明顯改變（P＞0.05）；20μM和100μM醋酸染鉛組細(xì)胞IGF1/IGF1R mRNA的表達

23、均低于對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.孕哺期母體鉛暴露可導(dǎo)致仔鼠血鉛和海馬鉛濃度明顯升高，抑制Aβ降解酶IDE及神經(jīng)生長因子NGF的表達，損傷仔鼠的空間學(xué)習(xí)能力，該損傷效應(yīng)呈暴露濃度依賴性。提示子代學(xué)習(xí)記憶能力障礙、腦AD樣神經(jīng)退行性變與孕哺期母體鉛暴露密切相關(guān)。
　　2.細(xì)胞染毒實驗結(jié)果與動物研究結(jié)果相一致。醋酸鉛暴露會對PC12細(xì)胞AD相關(guān)蛋白表達產(chǎn)生影響，該過程可能涉及胞內(nèi)信號通路蛋白的異常表達。鉛