緩控Lovastatin-PLGA微球復(fù)合水凝膠用于軟骨損傷的修復(fù)研究.pdf

1、本文對緩控Lovastatin-PLGA微球復(fù)合水凝膠用于軟骨損傷的修復(fù)進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：洛伐他汀對兔軟骨細(xì)胞的促增殖分化作用和保護作用及其機制研究。
　　目的：
　　探究洛伐他汀(lovastatin)對兔軟骨細(xì)胞的促增殖分化作用和保護作用及其機制研究
　　方法及結(jié)果：
　　不同濃度的洛伐他?。↙ovastatin）（0、0.5、2.0、3.5、5.0μM）分別作用于從新西蘭

2、白兔所提取的原代軟骨細(xì)胞24小時，48小時，72小時，然后采用CCK-8檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示在洛伐他汀的作用下，軟骨細(xì)胞增殖能力增強，在其濃度為2.0μM時，軟骨細(xì)胞增殖活力最佳。同時，在用2.0μM洛伐他汀預(yù)處理兔軟骨細(xì)胞24h后，采用Real-time quantitative PCR檢測軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白（COL2A1)和SOX-9基因的表達，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3）和凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3）的表達，結(jié)果顯示經(jīng)

3、洛伐他汀處理后，Ⅱ型膠原蛋白及SOX-9基因的表達上升，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3）和凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3）的表達下降。同樣，采用Western Blot檢測軟骨細(xì)胞中上述蛋白的表達，結(jié)果顯示與RT-PCR相同。說明洛伐他汀能促進軟骨細(xì)胞的增殖分化作用，同時能抑制凋亡相關(guān)蛋白。在加入白細(xì)胞介素-β1（10.0μM）預(yù)處理24h后，分別加入2.0μM洛伐他汀及2.0μM洛伐他汀聯(lián)用10.0μM U0126（MEK1/2抑制劑）

4、，用上述相同的實驗方法檢測相應(yīng)指標(biāo)，同時采用hoechst染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示在軟骨細(xì)胞炎性因子白細(xì)胞介素-β1（IL-β1）的作用下，Ⅱ型膠原蛋白及SOX-9基因的表達明顯下降，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3）和凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3）表達明顯上升，細(xì)胞凋亡程度明顯加重。而在洛伐他汀的作用下，Ⅱ型膠原蛋白及SOX-9基因的表達明顯下降，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3）和凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3）表達明顯

5、上升，軟骨細(xì)胞的凋亡程度減輕；而在聯(lián)用洛伐他汀與U0126（MEK1/2抑制劑）后，Ⅱ型膠原蛋白及SOX-9基因的表達再次明顯下降，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3）和凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3）表達明顯上升，細(xì)胞凋亡程度加重。
　　結(jié)論：
　　洛伐他汀通過激活MEK/ERK通路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖分化作用，同時對IL-β1介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡有保護作用。
　　第二部分：緩控Lovastatin-PLGA微球復(fù)合水凝膠的制

6、備和性能研究。
　　目的：
　　探究洛伐他汀聚乳酸-羥基乙酸微球復(fù)合水凝膠的制備及相關(guān)性能研究。
　　方法及結(jié)果：
　　選用生物相容性良好的PLGA（聚乳酸-羥基乙酸）微球（Microspheres）為藥物載體，采用單乳化-溶劑蒸發(fā)法來制備洛伐他汀聚乳酸-羥基乙酸微球，通過高效液相色譜分析技術(shù)（HPLC）檢測微球的藥物裝載率及實際含藥量，利用濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測該微球在釋放介質(zhì)（含2％十二烷基硫酸鈉的磷酸緩沖鹽溶液）

7、的濃度-時間釋放曲線，利用掃描電鏡(SEM)和動態(tài)激光粒度分析儀檢測微球的表觀和粒徑。接下來通過改良后的兩步交聯(lián)法制備微球/聚乙烯醇/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠(Microspheres/PVA/SA Hydrogel)，首先在90℃機械攪拌下制備聚乙烯醇溶液，冷卻至常溫加入海藻酸鈉，機械攪拌下使其完全溶解，再依次加入依地酸鈣（EDTA/Ca2+）和葡萄糖酸內(nèi)酯（Glucan Delta Lactone，GDL）以及之前制備好的載洛伐他汀微球（

8、Lovastatn-Microspheres），將混合溶液倒入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置入-80℃反復(fù)凍融，用蒸餾水沖洗掉凝膠多余的其他液體，制備得到微球/聚乙烯醇/海藻酸鈉復(fù)合水凝膠。同樣采用掃描電鏡(SEM)觀察復(fù)合水凝膠的形貌表征，高效液相色譜分析（HPLC）檢測復(fù)合水凝膠的洛伐他汀藥物釋放曲線，利用萬能試驗機測其壓縮-應(yīng)力的機械性能，最后通過CCK-8方法檢測復(fù)合水凝膠對軟骨細(xì)胞的生物相容性以及促增殖作用。結(jié)果表明：根據(jù)上述方法所制

9、備載洛伐他汀微球直徑大小不一，粒徑控制在247.1±58.9nm左右，藥物裝載效率達74.8±10.3%.，藥物釋放可持續(xù)20天，復(fù)合水凝膠有著多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)形貌，具備良好的機械性能，其中含5%微球（Microspheres），8%聚乙烯醇（PVA）,3%海藻酸鈉（SA）的復(fù)合水凝膠可承受縱向壓縮的最大壓強達57.14±4.20Mpa，藥物釋放可持續(xù)30天左右，含洛伐他汀的復(fù)合水凝膠作用于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)該材料的毒性作用，且可