用于脊髓損傷修復(fù)的NgR抗體-PLL復(fù)合HA水凝膠支架的構(gòu)建及其評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　神經(jīng)元細(xì)胞是人體內(nèi)再生能力最差的細(xì)胞之一，其構(gòu)成的神經(jīng)系統(tǒng)亦是人體內(nèi)至關(guān)重要的系統(tǒng)之一，因此神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生損傷往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆的后果[1，2]。如何實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞損傷后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)、再生直至神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)一直是相關(guān)學(xué)科的研究重點(diǎn)及難點(diǎn)[3-6]。
　　本實(shí)驗(yàn)將組織工程學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)及干細(xì)胞治療技術(shù)有機(jī)結(jié)合，為修復(fù)脊髓損傷(SCI)提供了新的方向[7，8]。成功修復(fù)脊髓損傷的關(guān)鍵在于:
　　①種子細(xì)

2、胞的選擇和培養(yǎng);
　?、诰哂欣硐肷锵嗳菪缘娜S立體框架材料的構(gòu)建[9-19];
　　③有助于神經(jīng)恢復(fù)的微環(huán)境的創(chuàng)建。本課題選擇神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)主要構(gòu)成之一透明質(zhì)酸(HA)作為三維立體框架主要原材料，制造該HA水凝膠復(fù)合支架，將可以穩(wěn)定分泌β-神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-NGF)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)與接枝Nogo-66受體抗體（NgR抗體）和多聚左旋賴(lài)氨酸(PLL)的HA支架共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染了β-NGF基因的EPCs與嫁接NgR

3、抗體以及PLL的HA支架的生物相容性，研究該HA支架作為修復(fù)SCI的組織工程學(xué)框架載體的可能性，為通過(guò)有機(jī)結(jié)合組織工程學(xué)及干細(xì)胞治療技術(shù)治療脊髓損傷等疾病提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　以冰凍干燥方法制備多孔HA水凝膠框架材料，將NgR抗體和PLL通過(guò)化學(xué)接枝法接枝到HA水凝膠支架上。提取EPCs，體外培養(yǎng)，取第三代EPCs用于試驗(yàn)研究，并通過(guò)攜帶β-NGF基因的腺病毒將其轉(zhuǎn)染，然后將EPCs與支架共培養(yǎng)。通過(guò)掃描電鏡觀察H

4、A水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通過(guò)細(xì)胞活力檢測(cè)(CCK-8)及HE染色法觀察EPCs在支架上的生長(zhǎng)情況，通過(guò)檢測(cè)支架/細(xì)胞復(fù)合物乳酸脫氫酶釋放量評(píng)價(jià)HA水凝膠支架材料細(xì)胞毒性，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real Time-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western blot)評(píng)估β-NGF基因在體外的表達(dá)、釋放情況。
　　結(jié)果：
　　成功培養(yǎng)出EPCs，其生長(zhǎng)良好、增值活躍，腺病毒攜帶β-NGF轉(zhuǎn)染EPCs

5、后其可以穩(wěn)定表達(dá)β-NGF。制造的HA水凝膠支架具備理想的三維孔狀結(jié)構(gòu)，EPCs在支架上生長(zhǎng)良好，且明顯優(yōu)于EPCs在培養(yǎng)板內(nèi)生長(zhǎng)，HA水凝膠支架的細(xì)胞毒性較培養(yǎng)板相比無(wú)明顯差異，且β-NGF在支架上表達(dá)與對(duì)照組相比存在明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　轉(zhuǎn)染了β-NGF的EPCs生長(zhǎng)旺盛并且能夠穩(wěn)定表達(dá)β-NGF，可以作為神經(jīng)組織工程學(xué)的種子細(xì)胞。EPCs可以在接枝NgR抗體和PLL的透明質(zhì)酸水凝膠支架上穩(wěn)定增值、表達(dá)，說(shuō)明EP