抗NgR疫苗的研制及其在修復(fù)脊髓損傷中的作用.pdf

1、軸突生長抑制分子是成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷后不能再生的重要因素之一。迄今已發(fā)現(xiàn)的來源于髓鞘的軸突生長抑制分子主要有三種：Nogo-A，MAG和Omgp，這三種分子有一個共同的受體，稱為Nogo-66受體（NgR）。在脊髓損傷（SCI）后，大量髓鞘破損，髓鞘中的抑制分子被暴露或釋放至損傷環(huán)境中，當(dāng)神經(jīng)元軸突上的NgR接觸到環(huán)境中的這些抑制分子時，其生長錐就會發(fā)生坍塌甚至回縮，導(dǎo)致?lián)p傷的軸突不能再生。因此，如果能封閉NgR的功

2、能，就有可能阻斷Nogo-A，MAG和Omgp 的抑制效應(yīng)。本研究旨在研制一種針對NgR的疫苗，通過疫苗免疫，使機(jī)體產(chǎn)生抗NgR抗體，從而阻斷NgR介導(dǎo)的軸突生長抑制效應(yīng)，并采用大鼠脊髓損傷模型對該疫苗的效果進(jìn)行評估，以期為中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)提供一種新的輔助治療手段。 本文第一部分工作是制備抗NgR的多克隆抗體。利用基因工程手段，原核表達(dá)并純化得到NgR分子的一個功能片段LRR，然后將其作為抗原免疫新西蘭兔獲得了高效價的抗體，W

3、estern Blot測定抗體效價>1:50000。利用該方法制備的抗NgR抗體可用于NgR分子的Western Blot及免疫組化檢測，亦可用于NgR的體內(nèi)外功能試驗研究，為下面的實驗提供了重要工具。 本文第二部分制備了抗NgR的DNA疫苗，并采用重物墜落大鼠脊髓傷模型對該疫苗的效果進(jìn)行了評估。將人NgR基因片段與人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hNgR-Fc，即抗NgR的DNA疫苗。通

4、過將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞，以及直接將質(zhì)粒注射至大鼠股四頭肌，我們證明該重組的DNA疫苗能成功表達(dá)融合蛋白hNgR-Fc。然后，采用脂質(zhì)體為佐劑，將該DNA疫苗通過肌肉注射，接種至成年SD大鼠。經(jīng)過三次免疫，僅少部分個體能撿出低效價的抗NgR抗體（1:200，ELISA）。但免疫大鼠脊髓損傷后，行為學(xué)檢測（BBB評分，網(wǎng)格試驗和腳印試驗）結(jié)果表明，抗NgR DNA疫苗免疫組大鼠的功能恢復(fù)明顯好于生理鹽水對照組，且產(chǎn)生抗NgR抗

5、體的個體功能恢復(fù)最佳。組織學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示，疫苗免疫組脊髓損傷空洞體積比對照組縮小了30.8％；免疫組化結(jié)果顯示，在損傷后8 w，疫苗免疫組大鼠脊髓組織中有大量的CD8＋T細(xì)胞的浸潤，提示抗NgR DNA疫苗免疫主要誘導(dǎo)了T細(xì)胞免疫，且該細(xì)胞免疫可能有利于脊髓損傷的修復(fù)。由于產(chǎn)生抗體的大鼠功能恢復(fù)優(yōu)于僅產(chǎn)生細(xì)胞免疫的個體，因此，促使疫苗誘導(dǎo)更多抗體是提高疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵。為此，本文又進(jìn)行了NgR蛋白疫苗的研制。 本文第三部分研制了

6、針對NgR的蛋白疫苗，并用大鼠脊髓半橫斷模型和重物墜落傷模型對該疫苗的效果進(jìn)行了評估。用重組的人NgR蛋白為抗原免疫大鼠后，所有個體均產(chǎn)生了高效價的抗NgR抗體（>1:8000，ELISA）；來自免疫大鼠的抗血清在體外可逆轉(zhuǎn)抑制分子MAG對小腦神經(jīng)元突起生長的抑制作用；免疫熒光染色顯示，在脊髓損傷后，外周產(chǎn)生的抗NgR抗體可以進(jìn)入脊髓損傷處，并可與其靶抗原NgR分子結(jié)合。在大鼠脊髓半橫斷損傷模型中，利用生物素化的葡聚糖胺（BDA）對大鼠

7、皮質(zhì)脊髓束（CST）進(jìn)行順行標(biāo)記后，結(jié)果顯示，經(jīng)NgR蛋白免疫的大鼠，75％的個體其部分切斷的神經(jīng)纖維可發(fā)生再生，并穿越損傷區(qū)，長入損傷的下游，部分個體其軸突再生的距離超過了10 mm；而對照組中，所有標(biāo)記的神經(jīng)纖維均停止于損傷部位的上游。在重物墜落脊髓損傷模型中，組織學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)NgR蛋白免疫的大鼠在脊髓損傷后，其損傷區(qū)空洞體積顯著縮小。而行為學(xué)試驗BBB評分和網(wǎng)格步行試驗的結(jié)果則進(jìn)一步證明，接種NgR疫苗后，兩種動物模型癱瘓后肢的