用于脊髓修復的絲素基定向多通道支架的研究.pdf

1、脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴重損傷，我國每年因高空墜落、交通事故等造成的嚴重脊髓損傷病例至少數(shù)萬例，而脊髓損傷的修復和重建一直是再生醫(yī)學領域的難題和研究熱點之一。目前，自體神經(jīng)移植仍然是嚴重脊髓缺損修復的主要手段。為了替代自體神經(jīng)移植物，減少供體不足和結(jié)構差異的限制以及二次手術的痛苦，恢復脊髓的正常結(jié)構和功能，迫切需要研制既具備促脊髓修復活性，又具有良好的生物相容性，且結(jié)構可調(diào)控的新型脊髓修復支架。國內(nèi)外的研究已初步證明絲素蛋白(SF

2、)用于修復神經(jīng)組織缺損具有一定的優(yōu)勢。若能進一步增強支架調(diào)節(jié)細胞行為的能力，并提高其引導細胞和組織生長的模板功能，則其有可能滿足脊髓損傷修復的需要。本文采用定向溫度場冷凍-干燥技術制備具有定向通道的SF支架，研究制備條件對支架結(jié)構和性能的影響，探討孔道的形成機制；在SF基定向多通道支架上原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，研究定向通道支架的結(jié)構對神經(jīng)元行為的影響；并通過動物實驗，研究SF基定向多通道支架植入后，促進脊髓缺損修復的活性及其機制。
　

3、　 首先，采用定向溫度場冷凍使冰晶定向生長，經(jīng)冷凍干燥、冰晶升華后制備出具有定向孔道的多孔SF支架，定向通道的內(nèi)表面存在大量的“脊”。支架具有良好吸水性能和孔的連通性，其孔徑隨著冷凍溫度的降低和SF溶液濃度的增大而減小，平均孔徑為40.29-238.49μm，孔隙率為54.29-93.13％。定向溫度場冷凍過程中，冰晶的定向生長對SF分子鏈段產(chǎn)生應力作用，同時SF溶液被濃縮，SF分子鏈段聚集、結(jié)晶，使支架內(nèi)β-sheet結(jié)構的含量增大

4、。改變絲素溶液中的化學勢分布，可以達到改變冰核或冰晶的尺寸、控制三維支架內(nèi)平行排列的孔道的直徑和形狀的目的。
　　 其次，在定向多通道SF支架表面引入層粘連蛋白(LN)，體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的結(jié)果表明，神經(jīng)元能夠以SF支架為載體生長，并能正常表達神經(jīng)元的標記性蛋白神經(jīng)絲(NF200)、生長相關蛋白(GAP43)、微管相關蛋白(MAP2)和β-Ⅲ-tubulin，幾乎不表達神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。神經(jīng)元多粘附在定向通道

5、的孔壁上，軸突沿孔道的方向延伸。進一步研究表明，定向多通道SF支架孔道內(nèi)表面的“脊”對神經(jīng)元具有引導作用，有利于神經(jīng)元的粘附、遷移和軸突的延伸。
　　 再次，將非定向SF支架、定向多通道SF支架和改性后的定向多通道SF支架三種材料植入SD大鼠背部正中T8-T10處脊髓半缺損部位，進行體內(nèi)試驗，結(jié)果顯示三種材料內(nèi)均無明顯的炎癥細胞浸潤，材料引起的機體免疫應答和炎癥反應輕微。組織修復細胞均能遷移進入材料內(nèi)部構建脊髓組織。改性后的定向

6、多通道SF支架中，再生軸突能夠貫穿缺損區(qū)域到達遠端實現(xiàn)橋接，且定向多通道支架中的毛細血管更豐富，新生組織和正常脊髓組織更接近。BBB功能恢復評分結(jié)果顯示，定向多通道支架組得分明顯高于非定向組，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 最后，采用多個因子免疫組化的方法探究定向SF支架促進脊髓修復的機制，定向多通道支架組內(nèi)GAP43、NF、神經(jīng)元特異性烯酸化酶(NSE)和β-Ⅲ-tubulin的陽性表達率高于非定向材料組，而GFAP的表

7、達量低于對照組，均有顯著性差異(P＜0.05)。這進一步說明SF基定向多通道支架具有促進脊髓損傷處軸突的再生、減輕瘢痕和利于脊髓重建的活性，同時也提示產(chǎn)生這一活性的機制是支架通過吸附體液中的活性成分和炎性細胞等，形成有利于細胞生長的微環(huán)境。細胞分泌生長因子并富集在支架內(nèi)，趨化神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等細胞向材料內(nèi)遷移，并通過支架定向通道的模板作用引導軸突的延伸和新生組織的形成，最終實現(xiàn)脊髓修復。
　　 通過本