可注射光固化水凝膠用于局灶性角膜損傷修復的研究.pdf

1、實驗目的：
　　為了改善角膜供體嚴重缺乏的現(xiàn)狀，本研究希望通過組織工程的方法尋找一種生物材料來作為角膜替代材料，用于局灶性損傷角膜的結構修復和視力恢復。明膠是一種天然生物材料，具有良好的生物相容性，分別通過丙烯酸酸酐和半胱胺進行改性，使其具有光固化的特性。將水凝膠前驅(qū)體填補局灶性角膜缺損處，再用特定波長的紫外光輻射固化，從而原位修復受損角膜。
　　實驗方法：
　　明膠（GE）與丙烯酸酸酐（AA）反應生成GE-AA，GE

2、與半胱胺反應生成GE-SH，對產(chǎn)物GE-AA和GE-SH進行核磁共振氫譜（1H NMR）分析，判斷接枝成功與否，并分別計算接枝率。通過改變 GE-AA/GE-SH的比例、紫外光強度與前驅(qū)體固含量來合成不同性能的水凝膠，再對合成的水凝膠進行流變學分析、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、透光率測定、溶脹率測定和體外降解性能測定，來分析不同條件下合成的水凝膠的不同理化性質(zhì)。通過 CCK-8體外細胞毒性實驗、死活細胞染色實驗以及細胞追蹤實驗，來研究

3、該水凝膠的體外生物相容性。通過3mm角膜環(huán)鉆移除新西蘭白兔角膜特定區(qū)域的上皮和基質(zhì)來構建角膜局灶性缺損模型，將滅菌處理后的水凝膠前驅(qū)體填補缺損組織并用365nm紫外光進行原位固化。通過裂隙燈觀察眼前節(jié)炎癥反應和角膜修復情況；通過角膜光學相干斷層掃描（OCT）來觀察角膜預后及眼底狀況，評估該水凝膠是否有助于促進角膜損傷修復及該植入方法是否對眼底有損害；通過角膜內(nèi)皮鏡檢查來觀察紫外光輻射對角膜內(nèi)皮細胞數(shù)量和形態(tài)的影響，從而評估該水凝膠及其植

4、入方法是否對角膜內(nèi)皮細胞有損害。通過水凝膠合成、理化性能分析、體外生物相容性實驗與動物體內(nèi)角膜修復實驗這一系統(tǒng)的實驗研究，對GE-AA/GE-SH水凝膠是否有助于局灶性角膜損傷修復作出結論。
　　實驗結果：
　　AA與GE在PH值為7.4～8.0的條件下可反應生成GE-AA；半胱胺與GE在PH值為4.0～6.0的條件下，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）和N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）催化下，反應生成G

5、E-SH。通過改變GE-AA/GE-SH的比例、紫外光強度與前驅(qū)體固含量可以獲得不同機械性能的水凝膠，同時通過固含量的改變還能夠調(diào)整水凝膠的微觀結構、透光性能、溶脹性能和降解性能，其中固含量是對水凝膠理化性能影響最大的因素。通過表征實驗，我們確定GE-AA/GE-SH水凝膠是一種高分子網(wǎng)絡結構，表面和內(nèi)部遍布直徑100～200μm的孔道，允許水和營養(yǎng)物質(zhì)透過，有利于為活細胞的生命活動提供物質(zhì)基礎；該水凝膠透光率大于90％，將其作為角膜損

6、傷修復材料應用于眼表對角膜的透光性影響?。涣己玫娜苊浶阅苁蛊渚哂泻芨叩奈?，有利于觸感的柔軟舒適和氧透過率的提高；良好的降解性能有利于角膜自身組織生長和替代水凝膠材料，最終達到角膜組織再生的目的。體外生物相容性實驗是評價該水凝膠對 L929小鼠成纖維細胞的影響。CCK-8體外細胞毒性實驗顯示，L929細胞能在該水凝膠表面粘附生長、分裂增殖，在7d內(nèi)無毒性反應與異常表現(xiàn)；死活細胞染色和細胞追蹤實驗表明，L929細胞被包載入該水凝膠、接受

7、365nm波長、100 mW/cm2光強紫外輻射2min后，7d內(nèi)大部分L929細胞仍然能夠在水凝膠支架內(nèi)遷移、增殖、生長，保持活力。最后將該水凝膠原位填補角膜缺損，裂隙燈觀察結果表明該水凝膠能夠促進角膜上皮的生長、角膜組織的修復；OCT檢查顯示該水凝膠能在一定程度上減少瘢痕的形成，對眼底組織無顯著影響；角膜內(nèi)皮鏡檢查表明紫外光輻射對角膜內(nèi)皮無明顯影響，動物眼壓基本保持穩(wěn)定。
　　實驗結論：
　　GE-AA/GE-SH可注射