過表達SOD1 G41S和G41D的重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及其在肌萎縮側(cè)索硬化N2a細胞模型中的作用探究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種快速進展、可累及上、下運動神經(jīng)元的嚴重致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病。研究發(fā)現(xiàn)，10％ ALS為家族性的ALS（familial ALS，fALS），其中約20％ fALS發(fā)病與超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1，SOD1)基因突變有關(guān)。在SOD1基因上存在兩種同一氨基酸位點上的不同突變SOD1 G41S和G41D，而攜帶這兩種突變

2、的患者臨床表現(xiàn)明顯不同，SOD1 G41S突變型fALS患者病程進展迅速，平均生存期約為11.6個月;而SOD1 G41D突變型患者病程進展較為緩慢，平均生存期約為17年。自1993年Rosen等人發(fā)現(xiàn)SOD1基因突變和ALS發(fā)病有關(guān)后，研究者對此種ALS致病機制進行了一系列研究，但至今尚不清楚。目前認為，氧化應(yīng)激、錯誤折疊蛋白聚集、線粒體功能障礙、谷氨酸鹽興奮毒性、軸索運輸損害、非神經(jīng)元細胞作用等都參與ALS的致病過程。另外，臨床研究

3、發(fā)現(xiàn)，ALS患者可出現(xiàn)軸突的高興奮性，表現(xiàn)為持續(xù)性的鈉電流增加，患者呈現(xiàn)出肌痙攣和肌束震顫;而先前也有研究發(fā)現(xiàn)在ALS G93A模型鼠原代脊髓運動神經(jīng)元、ALS患者誘導多能干細胞來源的運動神經(jīng)元及G93A模型鼠離體腦片中的運動神經(jīng)元都出現(xiàn)過度興奮的現(xiàn)象。電壓門控性鈉通道(voltage-gated sodium channel,VGSC)是神經(jīng)元的興奮和動作電位產(chǎn)生、傳導的重要元件，因此該通道電生理特性如果改變也將會影響神經(jīng)元的興奮性，

4、從而導致疾病的發(fā)生。先前研究報道ALS SOD1 G93A模型鼠在疾病早期神經(jīng)元VGSC電流出現(xiàn)異常。但是目前未有研究對SOD1 G41S和G41D突變的VGSC電生理特性進行探究。
　　因此，為進一步探究SOD1 G41S和G41D突變在ALS中的致病機制，將本研究分為兩個部分，首先構(gòu)建過表達野生型(wide type，WT)SOD1、SOD1 G41S及G41D重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associa

5、ted virus，rAAV）載體;用上述rAAV感染小鼠神經(jīng)瘤母細胞(N2a)以構(gòu)建ALS細胞模型，并觀察N2a細胞過量表達此兩種突變蛋白后，對神經(jīng)元VGSC電生理特性和凋亡分子表達的影響。
　　第一部分 SOD1 WT、SOD1 G41S和SOD1 G41D rAAV載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的：構(gòu)建過表達SOD1WT、SOD1 G41S及SOD1 G41D重組腺相關(guān)病毒載體。
　　方法：首先，利用PCR擴增各目的基

6、因片段，應(yīng)用EcoRⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶對pMT121（pAAV-hSyn-bGlobin intron-EGFP-pA）表達載體進行酶切后，回收純化線性化表達載體。進而在無縫反應(yīng)液作用下，將各目的片段與回收后的線性化表達載體進行同源重組后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。利用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測序，測序無誤后進行質(zhì)粒提抽。最后目的質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行病毒包裝，經(jīng)純化、濃縮、RT-PCR滴度測定后保存?zhèn)溆谩?br

7、>　　結(jié)果：PCR結(jié)果顯示，在約765 bp、792 bp、521 bp、175 bp、367 bp可見特異性RFP、GFP、SOD1W、5'SOD1 G41S/G41D、3'SOD1 G41S/G41D條帶;應(yīng)用EcoRⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶對表達載體pMT121進行雙酶切，回收4470 bp的線性化載體片段;菌落PCR轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果顯示，SOD1WT重組質(zhì)粒陽性克隆得到711 bp片段、SOD1 G41S和SOD1 G41D陽性克隆得

8、到721 bp片段;測序結(jié)果正確;72h后獲得3種SOD1 WT、SOD1 G41S和G41D rAAV顆粒，經(jīng)濃縮、純化、測定滴度分別為2.43×1012 v.g/mL、2.28×1012 v.g./mL、2.52×1012 v.g./mL后，分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　結(jié)論：成功構(gòu)建過表達SOD1WT、SOD1 G41S及SOD1 G41D rAAV載體，病毒純化、濃縮、滴度皆滿足后續(xù)實驗要求。
　　第二部分 SOD1

9、 WT、SOD1 G41S和SOD1 G41D rAAV載體在ALS細胞模型中的作用探究
　　目的：探究ALS SOD1上G41S和G41D兩種突變型所致神經(jīng)元VGSC電生理特性的差異及其可能的分子機制。
　　方法：構(gòu)建過表達SOD1 WT、SOD1 G41S及G41D rAAV載體后，體外感染N2a細胞，將實驗組分為3組:SOD1 WT組、SOD1 G41S和SOD1 G41D組，并以無目的基因rAAV感染的N2a細胞為陰

10、性對照(Control)組。利用全細胞膜片鉗技術(shù)分別記錄四組細胞VGSC電流，繪制通道快速激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線后分析相關(guān)參數(shù)。比較各組細胞凋亡分子Cleaved caspase-3在病毒感染后24、48和72 h不同時間點的表達情況。
　　結(jié)果：與Control組和SOD1 WT組比較，感染過表達SOD1 G41S、SOD1 G41DrAAV的細胞峰值電流顯著增加(P＜0.05)，且SOD1 G41S組顯著高于SOD1G41D組(P

11、＜0.01)。SOD1 G41S組和SOD1 G41D組細胞半數(shù)激活電壓和半數(shù)失活電壓顯著高于Control組和SOD1WT組(P＜0.05);但SOD1 G41S組半數(shù)激活電壓高于SOD1G41D組(P＜0.05);SOD1 G41S與SOD1G41D組半數(shù)失活電壓比較差異無顯著性(P＞0.05);各組激活、失活曲線斜率差異無顯著性(P＞0.05)。雖然24和48 h，SOD1WT、SOD1 G41S、SOD1 G41D組Cleave

12、dcaspase-3表達量差異無顯著性，但轉(zhuǎn)染72 h后，SOD1 G41S組和SOD1G41D組Cleaved caspase-3表達量高于SOD1WT組，且SOD1 G41S組高于SOD1G41D組。
　　結(jié)論：SOD1 G41S和SOD1 G41D突變通過加快VGSC快速激活和抑制失活過程提高神經(jīng)元活性，且SOD1 G41S突變VGSC活性顯著高于SOD1 G41D; SOD1G41S突變型ALS快速進展病程可能與該突變型促