IGF-1對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)模型的保護(hù)作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種進(jìn)行性、致死性的神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，主要侵犯腦和脊髓的上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，最終導(dǎo)致癱瘓和死亡。然而其確切的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚并且尚無(wú)行之有效的治療手段。
　　最近，在ALS和含有泛素陽(yáng)性包涵體的額顳葉癡呆患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了異常泛素化的蛋白聚集體，主要成分是43KD的TAR DNA結(jié)合蛋白(TDP43)，它由TARDBP基因編

2、碼。正常情況下TDP-43主要分布于細(xì)胞核，參與剪切和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。TDP43由414個(gè)氨基酸組成，包括兩個(gè)RNA識(shí)別區(qū)域和一個(gè)富含甘氨酸的羧基末端區(qū)域。最近研究表明TARDBP突變是ALS較為常見的一種基因突變，并且?guī)缀跛信cALS相關(guān)的TDP43突變都源于其羧基末端的甘氨酸富含區(qū)域。然而目前我們?nèi)圆磺宄蛔兊腡DP-43是通過(guò)毒性功能的獲得還是正常功能的丟失來(lái)介導(dǎo)神經(jīng)元退行性變的。突變的TDP43可以被截?cái)?，產(chǎn)生一個(gè)25KD的羧基末端

3、片段:TDP25，它更容易錯(cuò)誤折疊和聚集，在ALS的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，穩(wěn)定表達(dá)TDP25能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激及凋亡，具有細(xì)胞毒性作用。
　　運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元正常的生理功能依賴于神經(jīng)生長(zhǎng)因子持續(xù)、嚴(yán)格的調(diào)控，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元不同的發(fā)育階段，神經(jīng)生長(zhǎng)因子參與神經(jīng)元增殖、軸突生長(zhǎng)、突觸形成等重要生理過(guò)程。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)是一種神經(jīng)生長(zhǎng)因子，屬于胰島素家族。由于它在生長(zhǎng)及代謝方面的作用，IGF-1已經(jīng)

4、用于生長(zhǎng)因子缺乏和糖尿病等疾病的治療。目前，越來(lái)越多的人開始關(guān)注它對(duì)神經(jīng)變性性疾病的治療作用。最近研究表明IGF-1對(duì)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)都具有神經(jīng)保護(hù)作用。IGF-1可以激活PI3K/Akt和P44/42 MAPK信號(hào)通路，產(chǎn)生一系列的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，包括:細(xì)胞增殖、分化、抑制凋亡。另外，JPK、P38 MAPK和mTOR信號(hào)通路也與IGF-1相關(guān)。然而IGF-1信號(hào)系統(tǒng)十分復(fù)雜，受IGF-1受體(IGF-1R)及IGF-1結(jié)合蛋白(IG

5、FBPs)等多種因子的調(diào)控。對(duì)IGF-1系統(tǒng)的深入研究有可能為ALS治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　目的:研究IGF-1對(duì)穩(wěn)定表達(dá)TDP25蛋白的NSC34細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法:本研究采用TDP25穩(wěn)轉(zhuǎn)的NSC34細(xì)胞作為肌萎縮側(cè)索硬化的細(xì)胞模型。用不同濃度(0ng/ml，0.1 ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml) IGF-1干預(yù)穩(wěn)轉(zhuǎn)的NSC34細(xì)胞24小時(shí)，顯微鏡下觀察不同濃

6、度IGF-1干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)變化，并通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度IGF-1對(duì)細(xì)胞活力的影響，確定IGF-1最適藥物濃度;采用適當(dāng)濃度的IGF-1干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)后，通過(guò)LDH及MDA試劑盒檢測(cè)IGF-1是否能減少TDP25產(chǎn)生的細(xì)胞毒性;采用適當(dāng)濃度的IGF-1干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)后，通過(guò)Western免疫印記法檢測(cè)IGF-1對(duì)caspase3（凋亡標(biāo)記蛋白）和HO-1（抗氧化蛋白）表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)到

7、穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25質(zhì)粒的NSC34細(xì)胞中有外源性TDP25蛋白的表達(dá)，成功建立ALS細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)模型。
　　(2)不同濃度(0-1000ng/ml)IGF-1干預(yù)穩(wěn)轉(zhuǎn)NSC34細(xì)胞后，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)100ng/ml IGF-1能顯著促進(jìn)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)，維持細(xì)胞良好形態(tài);CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除0.1 ng/ml IGF-1外，其他不同濃度IGF-1給藥組均能提高細(xì)胞活力，并且10ng/ml及100ng/ml的IGF-1效果更好，所以最終我們選擇1

8、0ng/ml和100ng/ml作為IGF-1的最適濃度。依次用0ng/ml、10ng/ml（低劑量）、100ng/ml（高劑量）IGF-1干預(yù)穩(wěn)轉(zhuǎn)NSC34細(xì)胞24小時(shí)后，分別檢測(cè)不同IGF-1濃度下細(xì)胞毒性LDH及MDA水平變化，結(jié)果顯示與對(duì)照組比，給藥組兩個(gè)濃度下的IGF-1均能顯著降低LDH及MDA水平，且兩個(gè)給藥劑量組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(3)依次用0ng/ml、10ng/ml（低劑量）、100ng/ml（高劑量）

9、IGF-1干預(yù)穩(wěn)轉(zhuǎn)NSC34細(xì)胞24小時(shí)后，通過(guò)western印跡檢測(cè)caspase3、HO-1蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給藥組兩個(gè)濃度下的IGF-1均能抑制caspase3表達(dá)水平，并上調(diào)HO-1表達(dá)水平，而且高劑量組作用效果優(yōu)于低劑量組。
　　結(jié)論:在穩(wěn)定表達(dá)TDP25蛋白的ALS細(xì)胞模型中，IGF-1能夠降低TDP25產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，抑制凋亡和氧化應(yīng)激，且高劑量的IGF-1能夠促進(jìn)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)，具有明顯的細(xì)胞