芒果苷小檗堿鹽在HepG2細(xì)胞中調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用研究.pdf

1、天然產(chǎn)物芒果苷(mangiferin，M)作為一種氧雜蒽酮糖苷類(lèi)化合物在降脂、降糖、減肥、抗炎和抗氧化方面表現(xiàn)出良好效果，天然產(chǎn)物小檗堿(berberine，B)作為一種異喹啉類(lèi)生物堿在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面也表現(xiàn)出良好藥理活性。本研究首先運(yùn)用化學(xué)方法將M和B通過(guò)離子鍵連接形成單一的穩(wěn)定分子，制備新化合物芒果苷小檗堿(mangiferin-b erb erine，MB)鹽，然后對(duì)MB鹽在HepG2細(xì)胞中調(diào)控糖脂代謝的活性和機(jī)制進(jìn)行了深入研究，

2、并與M或B單獨(dú)應(yīng)用進(jìn)行了對(duì)比。
　　首先利用MTT法檢測(cè)了M，B，MB鹽三個(gè)化合物的體外毒性，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物處理濃度的選擇提供參考。接著Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)化合物對(duì)腺苷酸依賴(lài)的蛋白激酶α（AMP-activated protein kinaseα，AMPKα）第172位蘇氨酸(Thr172)和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）第79位絲氨酸(Ser79)磷酸化水平的影響，以試劑

3、盒檢測(cè)化合物對(duì)肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(camitine palmitoyl transferase1，CPT1)活力的影響。在調(diào)節(jié)糖類(lèi)代謝方面，通過(guò)試劑盒檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)基礎(chǔ)水平以及胰島素刺激的糖消耗的促進(jìn)作用;通過(guò)試劑盒檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)HepG2細(xì)胞糖異生的抑制作用，與此對(duì)應(yīng)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ph

4、osphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）mRNA表達(dá)水平的影響。在調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝方面，首先通過(guò)qPCR的方法檢測(cè)三個(gè)化合物對(duì)低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)mRNA表達(dá)水平的影響，接著利用油酸(oleic acid，OA)造模，建立HepG2細(xì)胞脂肪變性模型，通過(guò)

5、油紅O(ORO)染色法以及測(cè)定細(xì)胞內(nèi)三酰甘油(triglyceride，TG)含量的方法觀察三個(gè)化合物降低細(xì)胞內(nèi)脂肪的作用，與此對(duì)應(yīng)利用qPCR的方法檢測(cè)細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbohydrate-responsive element-binding protein

6、，ChREBP）及其靶基因如脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）和固醇輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）的mRNA表達(dá)水平。利用AMPK特異性抑制劑compound C(CC)進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞內(nèi)化合物M對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的的半數(shù)抑制濃度(IC50)大于400μM，化合物B對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50為133.9±10.6μM，化合物

7、MB鹽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50為131.0±9.4μM。
　　結(jié)果還表明三個(gè)化合物均能劑量依賴(lài)地促進(jìn)AMPK-α(Thr172)磷酸化、ACC(Ser79)磷酸化并增加CPT1活力，并且這些作用均能被CC預(yù)處理所完全阻斷。MB鹽刺激AMPK通路的效果顯著優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨(dú)應(yīng)用。在調(diào)節(jié)糖類(lèi)代謝方面，三個(gè)化合物均能促進(jìn)基礎(chǔ)水平糖消耗和胰島素刺激的糖消耗，且MB鹽的效果明顯優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨(dú)應(yīng)用。B和MB鹽能促

8、進(jìn)細(xì)胞乳酸釋放，而M沒(méi)有效果。MB鹽中的M部分通過(guò)AMPK依賴(lài)的方式來(lái)促進(jìn)細(xì)胞糖消耗，而其中的B部分通過(guò)AMPK非依賴(lài)的途徑來(lái)促進(jìn)糖消耗;MB鹽促進(jìn)細(xì)胞糖消耗的作用部分依賴(lài)于AMPK，而促進(jìn)細(xì)胞乳酸釋放的作用不依賴(lài)于AMPK。另外，MB鹽顯著抑制細(xì)胞糖異生，并且其作用也優(yōu)于M或B單用，且該作用依賴(lài)于AMPK。MB鹽在抑制糖異生的過(guò)程中能夠顯著下調(diào)糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase的mRNA表達(dá)水平。在調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝方面，MB鹽能顯著抑制

9、OA誘導(dǎo)的細(xì)胞脂肪變性，降低細(xì)胞內(nèi)TG含量，下調(diào)SREBP-1c，ChREBP，F(xiàn)as，SCD1mRNA表達(dá)水平，其效果顯著優(yōu)于同等摩爾濃度的M或B單獨(dú)應(yīng)用，且MB鹽的這種作用依賴(lài)于AMPK的激活。MB鹽在體外調(diào)控糖脂代謝的活性與同等摩爾濃度的M加B聯(lián)合應(yīng)用(M+B)相當(dāng)，但作為穩(wěn)定的單一分子，MB鹽在體內(nèi)可能更易吸收，具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　本研究表明，新化合物MB鹽通過(guò)激活A(yù)MPK/ACC/CPT1通路以及抑制脂肪合成