建立苦牛大力質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)及對(duì)其部分藥效進(jìn)行研究.pdf

1、目的:建立苦牛大力中芒柄花素和高麗槐素的含量測(cè)定方法，苦牛大力總黃酮（the total flavonoids of Radix Millettia Championi，F(xiàn)RMC）的抗炎和提高免疫作用以及對(duì)小鼠急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的保護(hù)作用及作用機(jī)制，并探討FRMC與甜牛大力總黃酮(the total flavonoidsof Radix Millettia Speciosa，F(xiàn)RMS)在抗炎、提高免

2、疫和保護(hù)ALI方面作用效果的差異，為苦牛大力在抗炎和提高免疫及保護(hù)ALI方面是否可作為甜牛大力的替代或補(bǔ)充品及其藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:1.含量測(cè)定:采用HPLC法，以芒柄花素和高麗槐素作為標(biāo)準(zhǔn)品，選用Welchrom-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），測(cè)定的色譜條件為:流動(dòng)相為乙腈-水(37.5:62.5)，芒柄花素的檢測(cè)波長(zhǎng)為248nm、高麗槐素的檢測(cè)波長(zhǎng)為309 nm，對(duì)苦牛大

3、力和甜牛大力中芒柄花素和高麗槐素含量進(jìn)行測(cè)定并比較其含量的差異。
　　2.抗炎和提高免疫作用的研究:采用二甲苯引起小鼠耳腫脹、角叉菜膠導(dǎo)致小鼠足腫脹、醋酸導(dǎo)致小鼠毛細(xì)血管通透性增加以及棉球置于小鼠腹股溝誘發(fā)肉芽腫炎癥模型及環(huán)磷酰胺制備小鼠免疫抑制模型來(lái)觀察FRMC的抗炎和提高免疫作用，并與FRMS抗炎和提高免疫作用進(jìn)行比較。
　　3.對(duì)ALI的保護(hù)作用:鼻腔滴注脂多糖(LPS)制備小鼠ALI模型，測(cè)定各組小鼠的肺系數(shù)、肺泡灌

4、洗液(broncholveolar lavage fluid，BALF)中白細(xì)胞(white blood cell，WBC)數(shù)目和總蛋白(Pro)含量、肺組織中超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase，SOD)和丙二醛(MDA)含量的變化;用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA法)測(cè)定各組小鼠肺組織中白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1bata(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)水平;采用蘇木精-伊紅染色法

5、(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的改變。
　　4.對(duì)ALI的保護(hù)機(jī)制研究:采用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠肺組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白的表達(dá)量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α、NF-κB p65及toll樣受體4(TLR4)mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果:1.苦牛大力和甜牛大力芒柄花素和高麗槐素的含量情況:苦牛大力＞甜牛大

6、力(P＜0.05)。
　　2.與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)RMC各劑量組均可明顯抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹、角叉菜引起的小鼠足腫脹，降低醋酸引起腹腔毛細(xì)血管通透性的增加，減輕小鼠肉芽腫(P＜0.05或P＜0.01);FRMC中、高各劑量及FRMS各劑量組均可提高免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)，F(xiàn)RMC和FRMS中、高劑量組均可提高免疫抑制小鼠的廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)

7、程度(P＜0.01或P＜0.05);其中，F(xiàn)RMC低、中劑量組對(duì)二甲苯引起的小鼠耳腫脹作用強(qiáng)于FRMS（P＜0.05），而對(duì)小鼠肉芽腫抑制作用弱于FRMS(P＜0.05)，在提高廓清指數(shù)方面，F(xiàn)RMC低劑量組強(qiáng)于FRMS(P＜0.05)，F(xiàn)RMC高、中劑量組提高DTH程度較FRMS相應(yīng)劑量組弱(P＜0.01或P＜0.05)。
　　3.與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)RMC和FRMS各劑量組可不同程度地降低小鼠肺系數(shù)、Pro滲出量（P＜0.05

8、或P＜0.01），減少小鼠BALF中WBC數(shù)（P＜0.05或P＜0.01），不同程度地增加肺組織中SOD的含量，減少M(fèi)DA的含量（P＜0.05或P＜0.01），不同程度地減少肺組織TNF-α、 IL-6、IL-1β的分泌量（P＜0.05或P＜0.01）;其中，F(xiàn)RMC高劑量組對(duì)提高SOD作用較FRMS弱(P＜0.01)，F(xiàn)RMC中、高劑量組對(duì)MDA的降低作用較FRMS弱(P＜0.05)，其他指標(biāo)FRMC與FRMS相應(yīng)劑量組作用效果相似(

9、P＞0.05);病理形態(tài)學(xué)檢查顯示:FRMC和FRMS均可改善肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺間質(zhì)增厚、肺水腫等情況，減輕LPS對(duì)小鼠肺組織的損害。
　　4.與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)RMC和FRMS各劑量組均可減少NF-κB p65蛋白在肺組織中的表達(dá)水平(P＜0.01);FRMC各劑量組可不同程度地抑制TLR4、NF-κB P65、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)量（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)RMS各劑量組可以降低肺組織中NF-κ

10、B P65、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)水平(P＜0.05)，F(xiàn)RMS中、高劑量組可抑制TLR4 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05或P＜0.01）;與FRMS相應(yīng)劑量組比較，F(xiàn)RMC低劑量組抑制小鼠肺組織中NF-κB p65蛋白、NF-κB P65及TLR4 mRMA的表達(dá)強(qiáng)于FRMS（P＜0.01），F(xiàn)RMC高劑量抑制IL-6 mRMA的表達(dá)強(qiáng)于FRMS（P＜0.05），余下指標(biāo)，F(xiàn)RMC和FRMS作用效果相似(P＞0.05)。