基于線粒體功能失調(diào)與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激探索柚皮素對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　為探討柚皮素對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制，本研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別采用體外原代皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)糖氧剝奪/再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/Rep)模型和大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MACO)模型，從體外和動(dòng)物模型不同角度探索柚皮素干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其與線粒體功能失調(diào)以及核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)通路調(diào)控的抗氧化

2、應(yīng)激的關(guān)系，明確柚皮素對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)理。
　　方法:
　　體外研究實(shí)驗(yàn):
　　1、用NES-FITC及DAPI對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。
　　2、SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞建立OGD/Rep模型。
　　3、(1)用不同濃度NAR干預(yù)48h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。(2)檢測(cè)凋亡蛋白Capase-3、bax、bcl-2、Cyt C蛋白和基因表達(dá)水平。(3)電鏡觀

3、察各組線粒體結(jié)構(gòu)，檢測(cè)其膜電勢(shì)和腺苷酸含量變化。(4)檢測(cè)ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。
　　4、(1)siRNA-Nrf2、OENrf2干擾Nrf2表達(dá)，行OGD/Rep處理，再給予80Mm NAR處理48h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。(2)檢測(cè)ROS、MDA和GSH水平及SOD活性。(3)檢測(cè)Nrf2蛋白轉(zhuǎn)移情況以及其與ARE結(jié)合的情況。(4)檢測(cè)Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1蛋白和基因表達(dá)水平。
　　體內(nèi)

4、研究實(shí)驗(yàn):
　　1、利用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)動(dòng)物模型，給予不用濃度NAR處理，術(shù)后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、TTC染色、腦含水量測(cè)定以及HE染色。
　　2、給予MCAO模型不同濃度NAR處理72h后，(1)電鏡掃描觀察各組線粒體結(jié)構(gòu)，檢測(cè)其膜電勢(shì)和腺苷酸含量變化;(2)檢測(cè)腦組織內(nèi)ROS、MDA和GSH水平及SOD活性;(3)觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)腦組織Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1蛋

5、白表達(dá)情況，檢測(cè)Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1基因表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)Nrf2的DNA結(jié)合活力和Keap1亞硝基化情況。
　　結(jié)果:
　　體外研究結(jié)果:
　　1、與正常對(duì)照相比，模型組細(xì)胞活性低，凋亡率高，差異顯著(P＜0.05)，與模型組對(duì)比，不同濃度NAR預(yù)處理后，細(xì)胞活性提高、凋亡率下降，NAR-H組最為顯著(P＜0.05)。
　　2、與正常組比較，模型組Capase-3，bax及Cyt C表達(dá)上調(diào)

6、，bcl-2表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。與模型組相比，經(jīng)過不同濃度NAR預(yù)處理后，Capase-3，bax及Cyt C表達(dá)下調(diào)，bcl-2表達(dá)上調(diào)。其中NAR-H組最為顯著(P＜0.05)。
　　3、NAR預(yù)處理可改善線粒體形態(tài)，提高其膜電位及腺苷酸合成能力，提高SOD、GSH水平，降低ROS、MDA水平。
　　4、與模型組比較，轉(zhuǎn)染OENrf2組和NAR組細(xì)胞活性提高，凋亡率下降，OENrf2組最為顯著(P＜0.05);轉(zhuǎn)染

7、Nrf2-siRNA組則相反(P＜0.05)。
　　5、與模型組比較，轉(zhuǎn)染OENrf2組和NAR組SOD、GSH水平提高，ROS、MDA水平下降，OENrf2組最為顯著(P＜0.05);轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA組則無明顯差異(P＞0.05)。
　　7、與模型組比較，轉(zhuǎn)染OENrf2組和NAR組細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)增加，而胞漿表達(dá)減少，OENrf2組最為顯著(P＜0.05);轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0

8、.05）。
　　8、NAR誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)，促進(jìn)Nrf2通路下游蛋白Nrf2、Keap1、HO-1和NOQ1的表達(dá)。
　　體內(nèi)研究結(jié)果:
　　1、NAR預(yù)處理組腦梗死面積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦水含量均顯著優(yōu)于模型組。
　　2、NAR預(yù)處理組線粒體正常結(jié)構(gòu)增加、膜電位增強(qiáng)、腺苷酸合成能力提高，氧化應(yīng)激水平降低，與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、NAR預(yù)處理組細(xì)胞凋亡減少，提高Keap1巰基亞硝基化