電針百會(huì)、足三里穴對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠EPO介導(dǎo)的JAK2-STAT3信號(hào)的影響.pdf

1、目的：腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI)的病理機(jī)制非常復(fù)雜。腦缺血再灌注損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用與促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)介導(dǎo)的酪氨酸激酶2（Janus family tyrosine kinases-2，JAK2）/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcnpt

2、ion-3，STAT3)細(xì)胞通路關(guān)系密切，是目前研究熱點(diǎn)之一。本研究采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型，探討電針百會(huì)、足三里穴對(duì)大鼠EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腦水腫和細(xì)胞凋亡的影響，為臨床治療缺血性腦血管病進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:SPF級(jí)成年雄性SD大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（每組12只）：假手術(shù)組（S組）、模型組（M組）和電針百會(huì)、足三里組（EA組）。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總、頸

3、內(nèi)和頸外動(dòng)脈，不插入線栓;模型組制作采用線栓法大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷模型，假手術(shù)組和模型組大鼠不干預(yù)，僅接受同電針組一樣的抓取束縛刺激。電針組造模成功后取百會(huì)、左足三里穴電針干預(yù)，采用長(zhǎng)城牌KWD-808Ⅱ電針儀，疏密波、頻率2-100Hz、強(qiáng)度約2mA，以肌肉收縮為度，時(shí)間為20min。電針組干預(yù)共2次。第一次干預(yù)在拔線栓后，第二次干預(yù)在處死前2h。模型組和電針組大鼠腦缺血2h再灌注，再灌注24h后麻醉處死。在腦缺血后2h及處死前

4、采用Ludmila Belayev12分評(píng)分法檢測(cè)各組大鼠運(yùn)動(dòng)、感覺完整性。處死前采用前肢踩空實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠前肢對(duì)感覺及運(yùn)動(dòng)的整合能力，采用網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組大鼠前爪抓握能力及肌力情況。TTC染色檢測(cè)各組大鼠腦梗死體積，HE染色檢測(cè)缺血腦組織組織形態(tài)學(xué)的改變。免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織EPO/EpoR，JAK2/STAT3以及AQP9的表達(dá)情況。免疫熒光雙染法檢測(cè)大鼠腦組織中JAK2和神經(jīng)元，JAK2和星型膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)的情況。Wes

5、tern Blot和qPCR方法檢測(cè)大鼠腦組織中EPO，EpoR，磷酸化的JAK2和STAT3，總的JAK2和STAT3以及水通道蛋白9(AQP9)mRNA和蛋白表達(dá)。原位末端標(biāo)記(terminaldeoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，Tunel)染色法檢測(cè)腦組織中神經(jīng)元凋亡的情況。免疫熒光法觀察EPO+細(xì)胞和TUNEL+細(xì)胞共表達(dá)情況。

6、>　　結(jié)果:1.電針百會(huì)、足三里穴對(duì)缺血腦組織組織形態(tài)學(xué)的影響TTC染色示模型組大鼠腦組織缺血區(qū)域變白，與周圍正常鮮紅腦組織形成對(duì)比。假手術(shù)組大鼠腦組織無明顯白色，電針組大鼠腦缺血程度較模型組輕。顯示腦缺血區(qū)域集中在大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域（主要是皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)）。HE染色示假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠腦組織缺血區(qū)域組織疏松，細(xì)胞間隙變大，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，核仁模糊不清，甚至固縮或者消失。電針細(xì)大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)域組織疏松程度較模型組

7、程度輕，且固縮細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)量減少。2.電針百會(huì)、足三里穴對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的改變Ludmila Belayev12分評(píng)分法提示假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分正常。模型組大鼠Ludmila Belayev12評(píng)分最為嚴(yán)重。缺血2h的評(píng)分?jǐn)?shù)值比缺血后24h的更高。2h模型組和電針組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;24h時(shí)間點(diǎn)電針組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于模型組（P＜0.05）。模型組和電針組大鼠的前肢踩空實(shí)驗(yàn)評(píng)分較假手術(shù)組明顯升高，電針可以明

8、顯改善CIRI后大鼠的前肢踩空實(shí)驗(yàn)評(píng)分(P＜0.05)。模型組和電針組大鼠的網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分較假手術(shù)組明顯升高，電針可以明顯改善腦缺血再灌注損傷CIRI后大鼠的網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分(P＜0.05)。3.電針百會(huì)、足三里穴對(duì)大鼠EPO-JAK2/STAT3信號(hào)通路表達(dá)的影響免疫組化、Western Blot以及qPCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠的EPO，EpoR mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，電針組與模型組比

9、較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化，Western Blot以及qPCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠的JAK2/STAT3mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，電針組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western Blot提示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠腦組織中有活性的JAK2，STAT3(p-JAK2，p-STAT3)水平和總的JAK2，STAT3的比值p-JAK2/

10、JAK2，p-STAT3/STAT3明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，電針組與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4.JAK2在腦組織中的細(xì)胞定位免疫熒光雙染結(jié)果顯示：腦組織缺血半暗帶區(qū)域，JAK2陽性細(xì)胞趨于在NeuN陽性細(xì)胞中表達(dá)，而EPO陽性細(xì)胞和GFAP陽性細(xì)胞重合較少。提示JAK2主要在神經(jīng)元表達(dá)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少。5.電針百會(huì)、足三里穴對(duì)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色提示：模型組大鼠腦組織中有大量

11、凋亡細(xì)胞表達(dá)。與模型組相比，電針百會(huì)、足三里穴可以明顯減少腦組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)目。模型組大鼠腦組織TUNEL染色和EPO免疫熒光雙染提示：腦組織中TUNEL陽性細(xì)胞和EPO陽性細(xì)胞趨于分離，提示腦缺血后對(duì)大鼠腦組織有保護(hù)作用的EPO表達(dá)增加，且對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作用。6.電針百會(huì)、足三里穴對(duì)腦組織水腫相關(guān)蛋白AQP9的影響免疫組化、Western Blot以及qPCR結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組、電針組大鼠的AQP9mRNA和蛋白表

12、達(dá)明顯升高，差異顯著（P＜0.05），電針組與模型組比較，可以明顯降低腦組織中AQP9mRNA和蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）。
　　結(jié)論:1.電針百會(huì)、足三里穴可對(duì)腦缺血大鼠產(chǎn)生以下影響：(1)其腦組織中腦梗死體積減少、細(xì)胞固縮和異常增生減輕。(2)有效改善大鼠Ludmila Belayev12分評(píng)分，前肢踩空實(shí)驗(yàn)評(píng)分，網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)分。(3)可上調(diào)p-JAK2，p-STAT3蛋白，同時(shí)上調(diào)EPO，EpoR，JAK2，STAT3mRN

13、A和蛋白表達(dá)。激活EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血再灌注損傷腦組織，同時(shí)下調(diào)腦水腫相關(guān)蛋白AQP9mRNA和蛋白的表達(dá)。2.缺血再灌注損傷大鼠腦組織中JAK2發(fā)揮作用的細(xì)胞位點(diǎn)主要在神經(jīng)元，而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞。[創(chuàng)新點(diǎn)]本研究發(fā)現(xiàn)，針刺大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血再灌注模型大鼠百會(huì)、足三里穴可明顯減輕腦水腫、減少細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與激活EPO介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路、上調(diào)p-JAK2，p-STAT3，EPO，Ep